广东省河源地区献血人群隐匿性乙型肝炎病毒感染的血清学及分子生物学特征分析

刘丽华，叶贤林，程丽娜，聂湘辉,黄 璐，叶登凰，李 彤

（1.河源市中心血站，广东河源 517000；2.深圳市血液中心，广东深圳 518035)

隐匿性乙型肝炎病毒感染（occult hepatitis B virus infection ,OBI）定义为根据现有检测方法机体HBsAg 检测阴性，肝脏和/或血液存在HBV DNA的一种状态，根据是否存在血清学标记物抗-HBc和/或抗-HBs 分为血清学阳性OBI 与血清学阴性OBI[1]。OBI 可经输血或器官移植等方式传播HBV，与慢性肝损伤或肝细胞癌有关；OBI 个体在免疫机能下降或处于免疫抑制状态时可导致HBV 活化[2]。迄今为止国内外已对OBI 在流行病学、发生机制、临床意义等方面做了大量调查研究[2-5]，但广东河源地区无相关报道。河源市中心血站自2016年1月1日起对所有献血标本在两种酶免试剂检测的基础上增加了HBV，HCV，HIV 混合分项核酸检测（nucleic acid test，NAT），筛查出了比其他地区更多的HBsAg-/HBV DNA+标本，提示河源可能为OBI 流行地区，输血安全受到严重威胁。为了解本地区献血者OBI 的血清学及分子生物学流行特征，为输血安全防控提供数据支撑，特对HBsAg-/HBV DNA+标本进行了多方法检测和确认，报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2016年1月1日～2018年5月31日河源市中心血站采集的47 021 例无偿献血者，所有献血者经体检、乙肝表面抗原胶体金试纸条快速检测、谷氨酸氨基转移酶(ALT)罗氏干式试纸条初筛及血红蛋白初筛合格。采集无偿献血者EDTA-K2抗凝全血标本两支，分别用于NAT（8 ml，带分离胶）和ELISA，ALT（5 ml，不带分离胶）检测。所有无偿献血者都签署知情同意书，符合医学伦理学。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器：深圳爱康Xantus44/OH-150 全自动加样仪；UranusAE 268 全自动酶免仪；德国西门子BEPIII 全自动酶免分析仪；深圳迈瑞BS-420 全自动生化分析仪；上海浩源ChiTas BSS1200 全自动血液核酸检测仪；美国ABI 7500 是实时荧光定量PCR 仪；美国罗氏Cobas E602 全自动电化学发光分析仪；美国ABI9700 巢氏PCR 扩增仪；德国Eppendorf5804 台式离心机；美国AgilentMX3005P实时荧光定量仪；姜堰市新康医疗420B 电热恒温水浴锅；北京百晶六一2502 水平式电泳仪；北京鼎国UV254 暗箱式紫外透射仪；上海山富Biotop5C810 凝胶成像系统。

1.2.2 试剂：ELISA 检测试剂：HBsAg 采用法国伯乐及珠海丽珠公司试剂；抗-HCV 采用北京万泰及珠海丽珠公司试剂；HIV-Ag/Ab 采用法国伯乐及珠海丽珠公司试剂；抗-TP 采用北京万泰及珠海丽珠公司试剂。ALT 的检测采用迈瑞公司试剂。NAT采用上海浩源公司试剂。乙肝病毒血清标志物定量采用罗氏公司试剂。病毒提取采用美国罗氏公司（High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit）试剂。HBV 病毒载量测定采用大连宝生物公司的Premix Ex Taq(Perfect Real Time)。血源筛查试剂均为国家检定权威机构批检合格产品。

1.3 方法

1.3.1 血清学检测：采用2 个不同生产厂家的ELISA 试剂对所有研究对象标本进行HBsAg,抗-HCV,抗-TP 及HIV-Ag/Ab 检测。如双试剂或任一试剂S/CO ≥0.8，判为不合格；双试剂S/CO＜0.8，判为合格。ALT 速率法检测结果＞50U/L判为不合格。实验室常规筛查HBsAg-/HBV DNA+的标本外送第三方检验机构广州金域医学检验中心有限公司做电化学发光HBsAg,抗-HBs 定量及HBeAg,抗-HBe,抗-HBc 定性检测。

1.3.2 核酸检测：排除HBsAg,抗-HCV,抗-TP,HIVAg/Ab 及ALT 检测不合格标本，对ELISA 及ALT检测结果合格的44 596 例标本，采用上海浩源公司的ChiTas BSS1200 全自动血液核酸检测仪以150 μl×8 混样模式提取血浆标本病毒核酸，进行荧光PCR HBV，HCV，HIV 分项检测，对混样检测阳性的标本进行单人份拆分检测，拆分阳性判为不合格。对实验室常规筛查HBsAg-/HBV DNA+标本取2.5 ml 血浆做病毒核酸大容量提取，提取过程严格按照试剂说明书操作。目的基因扩增及病毒载量测定方法参考文献[6]。

1.3.3 进化树的构建：在国际基因库选取A～I基因型HBV 野毒株各3 例，用MEGA7.0 系统进化软件以邻接法验证复数1 000，构建系统进化树。

1.3.4 HBsAg-/HBV DNA+判定标准：2 个不同厂家ELISA 试剂及电化学发光试剂检测HBsAg 结果均为阴性则判为HBsAg 确证阴性。对于上海浩源NAT HBV DNA 阳性的标本，满足以下2 种情况的任意一种即为HBV DNA 确证阳性：①巢式PCR S片段或者BCP 片段其中1 个阳性; ②实时荧光定量PCR（qPCR）阳性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析，分类变量资料采用χ2检验，连续变量资料中两个独立样本非参数检验采用Mann-Whitney U 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OBI 总体检出情况 2016年1月1日～2018年5月31日 共 对44 596 例ELISA 及ALT 合格标本进行NAT，检出浩源HBV DNA 阳性标本83 例，其中3 例电化学发光法检测HBsAg 阳性，为无症状慢性感染，69 例确认HBsAg-/HBV DNA+。其中1 例血清学标志物全阴，为窗口期感染；其余68例血清学标志物抗-HBc 或抗-HBs 阳性，确认为OBI，OBI 检出率为0.15%(68/44 596，1∶656)。

68 例OBI 献血者包括男性59 例（86.8%），女性9 例（13.2%）；初次献血者40 例（58.8%），重复献血者28 例（41.2%）；河源籍57 例（83.8%），非河源籍11 例（16.2%）。OBI 检出率男性高于女性，初次献血者高于重复献血者，河源籍高于非河源籍，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。不同年龄段OBI 检出率差异有统计学意义（P＜0.05）,其中 18～26 岁组检出率最低，随年龄增长检出率增高。见表1。

表1 OBI 在不同性别、年龄及献血次数的献血者中的分布特征

2.2 OBI 血清学标志物检测情况 OBI 血清学模式见表2，其中抗-HBs-抗-HBc+ 40 例（58.8%），抗-HBs+抗-HBc+ 27例（39.7%），抗-HBs+抗-HBc-1 例（1.5%）。抗-HBs 定量38 例（55.9%）小于10 IU/L，21例（30.9%）为10～100 IU/L，9例（13.2%）大于100 IU/L。不同血清学模式抗-HBs 定量分布差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表2 OBI 献血者血清学标志物模式（n=68）

表3 不同血清学模式OBI 抗-HBs 浓度及病毒载量分布情况

2.3 OBI 病毒载量测定情况 见表3。68 例OBI标本，10 例不可定量，其余58 例（85%）获得定量结果，病毒载量范围为1.08～1 383.93IU/ml(中位数34.38 IU/ml)，见图1。不同血清学模式病毒载量分布差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 OBI PCR 检测及基因分型情况 见表4。联合巢式PCR BCP 区，S 区扩增及qPCR 对实验室常规NAT 检测阳性的标本进行确认，其中三项检测结果均为阳性23 例（33.8%），任意两项阳性48 例（70.6%），任意一项阳性68 例（100%）。43 例可分型的OBI 标本中，B 基因型41 例（95.3%），C 基因型2 例（4.7%）。

图1 OBI 病毒载量分布图

表4 巢式PCR 联合qPCR 检测情况（n=68）

3 讨论

OBI 作为HBV 感染的一种特殊形式，其流行率根据HBV 流行病学特点在不同的地理区域和人群之间存在差异。此外，研究所用的检测方法及其特异度和敏感度，选择的被检测材料（例如原样管血浆、血袋浆）等均影响OBI 的检出率。我国2 个由国家临床检验中心组织的涉及826 044和1 205 796 标本量的跨越南北多中心联合调查研究显示OBI 的检出率分别为0.08%(1:1 200)和0.07%(1:1 527)[7-8]。河源地区献血人群OBI 检出率为0.15%(1:656)，高于上述全国平均水平，同时高于同为粤北的韶关（0.09%,1:1 126）[9],低于深圳（0.22%，57/26 263）[6]。本研究在实验室常规筛查方法的基础上分别采用灵敏度更高的电化学发光法、巢式PCR 及qPCR 对HBsAg-/HBV DNA+标本进行确认,已最大程度降低了假阳性对OBI 检出率的干扰。数据统计显示河源籍OBI 检出率为0.186%，非河源籍OBI 检出率0.078%，与全国平均水平相当，说明河源地区OBI 检出率偏高的主要原因为河源当地HBV 感染基数较高。我国总体献血人群献血后ELISA 检测阳性率为0.7%[7]，而河源地区献血人群献血后ELISA 检测阳性率为1.11%[10]，远高于全国平均水平，也提示河源地区HBV 感染基数较高。深圳献血人群HBsAg 阳性率低于河源，而同期OBI 检出率却比河源高[6]，在两研究对HBsAg 和HBV DNA 确认标准及OBI 判定标准一致的基础上，分析主要原因为两地采用的NAT 体系灵敏度有差异，深圳采用灵敏度较高的第二代单人份检测体系，而河源采用的是8 样本混合检测体系。若河源地区采用单人份NAT 体系，预计OBI 检出率将高于深圳报道的0.22%。这提示目前河源地区采用的8 样本混合检测体系存在较高的OBI 血液漏检风险，应选用灵敏度更高的单人份NAT 系统以进一步提高OBI 标本的检出率，降低经输血传播HBV 风险。

与嘉兴地区[11]报道的相同，本研究OBI 检出率在不同性别、年龄及献血次数人群间差异均有统计学意义（P＜0.05），男性高于女性，初次献血者高于重复献血者，并随年龄增长检出率增高，其中18～26 岁组检出率最低。1992年我国把乙肝疫苗纳入免疫规划，18～26 岁年龄段人群为计划免疫后出生群体，推测乙肝疫苗的接种降低了该年龄段献血人群HBV 感染的风险，与叶贤林、HSU[6，12]等研究结论相符。OBI 检出率随年龄增长而增高，提示长期反复暴露在HBV 环境中是导致OBI 的一个重要原因。CANDOTTI 等[13]表示除了撒哈拉以南非洲地区外，OBI 献血者的年龄趋向于45 岁以上，表明OBI 处于慢性HBV 携带后期。本研究统计OBI 献血者年龄范围为20～56 岁（中位年龄38.5 岁，平均年龄39 岁），不足以说明OBI 处于慢性HBV携带后期的观点。国内报道的OBI 献血者相对年轻，如江苏平均36.9 岁[14]、福建平均37.4 岁[15]。有观点认为非洲与东南亚地区HBV 主要通过母婴垂直传播或者在幼童时期感染，而欧洲地区HBV 的感染主要是在15 岁后通过毒品注射或性传播，因此发展为OBI 的年龄也相对较大[16]40。此外，不同区域OBI 感染者的年龄差异是否与不同区域间基因型差异有关有待进一步研究确认。

乙肝病毒血清标志物检测结果显示河源地区OBI 献血者绝大多数（98.5%）是以抗-HBc 阳性为主的血清学阳性OBI，1 例(1.5%)单独抗-HBs 阳性。在血清学阳性的OBI 献血者中，HBsAg 可能在急性HBV 感染自限性恢复后或慢性HBV 感染数十年后变为阴性。抗-HBc 与HBV 的自然感染有关，存在于免疫能力正常个体慢性感染的全过程，即使在感染康复后依然持续存在，常作为OBI 的替代检测标记。1 例单独抗-HBs 阳性献血者出生于实行计划免疫后的1994年，可能为疫苗突破性感染。

澳大利亚SEED 等[17]经过回顾性分析认为绝大多数与OBI 血液相关的输血感染抗-HBs 均不高于10 IU/L。国内外均有报道认为血液中抗-HBs 大于100 IU/L 时，血液是相对安全的[18],[16]190-199。日本则认为对于抗-HBc 阳性的血液，抗-HBs 大于或等于200 IU/L 才相对安全[16]190-199。本研究59 例（86.8%）OBI 献血者抗-HBs 定量小于100 IU/L，38 例（55.9%）小于10 IU/L，提示有较高的经输血传播HBV 风险。当然，OBI 经输血传播HBV 的概率应综合考虑献血者、受血者双方的抗体水平，受血者免疫状态、输入血浆的量以及血液病毒载量等因素。

对河源地区OBI 标本进行病毒载量测定显示其中10 例不可定量，其余58 例病毒载量中位数为34.38 IU/ml，与报道的中位数通常在10 ～50IU/ml相符[13]。血液中HBV DNA 的持续低水平复制是OBI 的一大特点，急性或慢性HBV 感染后HBsAg消失所致OBI 血清HBV DNA 水平通常很低[19]；HBV S 基因剪接突变所致的OBI 病毒载量低或检测不到，S 基因逃逸突变或启动子突变所致OBI 病毒载量与显性感染者相当[1]。推测本研究中3 例病毒载量大于1 000 IU/ml 献血者，可能为S 基因逃逸突变或启动子突变所致。经统计，抗-HBs 阳性OBI 献血者病毒载量明显低于抗-HBs 阴性OBI 献血者(U=333.000, P=0.008)。结合该统计数据，针对目前受到广泛关注的单检鉴别阴性或混检拆分阴性标本仍存在HBV残存风险的问题，若引入抗-HBc及抗-HBs 检测，淘汰抗-HBc+/抗-HBs-标本应能进一步降低HBV 残存风险。

本研究联合巢式PCR S 区，BCP 区扩增及qPCR对实验室常规NAT检测阳性的标本进行确认，其中三项检测结果均为阳性23 例（33.8%），任意两项阳性48 例（70.6%），任意一项阳性68 例（100%），提示联合多种检测方法可以提高OBI检出率。基因分型显示95.3%（41/43）为B 基因型，4.7%（2/43）为C 基因型，2 例C 基因型献血者户籍分别为河南省与山东省，符合我国南方HBV 以B 型为主的分布规律[20]。

综上所述：河源地区献血人群OBI 检出率相对较高，以B 基因型为主。应选用灵敏度更高的单人份核酸检测系统以进一步提高OBI 标本的检出率，降低经输血传播HBV 风险。