三七真空冷冻干燥工艺优化及对活性成分影响的研究

刘胜男， 王承潇， 杨 野， 杨晓艳， 韩 伟， 崔秀明,3

（1.昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650500；2.华东理工大学药学院，制药工程与过程化学教育部工程研究中心，上海 200237；3.云南省三七重点实验室，昆明 650500）

三七 （Panax notogiseng）为五加科人参属植物[1]，主产于云南、广西等省。三七总皂苷[2]（Panax notoginsengSaponins , PNS）和三七素为三七中的主要活性成分。PNS 约占三七总质量的6%～10%，具有良好的止血功效，能明显缩短出血和凝血时间，促进人体红细胞分裂、生长，还具有明显补血功效，并能显著提高巨噬细胞吞噬率，提高血液中淋巴细胞比值，具有活血化瘀、祛瘀生新的疗效，主要用于心脑血管疾病的治疗。三七素[3]又称三七氨酸、田七氨酸，是一种水溶性非蛋白氨基酸，具有较强的止血、凝血及神经系统保护作用。

本文中真空冷冻干燥的干燥方式在冻结状态下完成，因而样品切片的物理结构及分子结构变化较小，组织结构和外观形态能被较好保存；此外真空条件使样品隔绝空气，更加有效地保持了原料的色泽，有效成分品质显著提升，样品外观品质较好[4]。真空冷冻干燥机的折旧率较高，加工成本的主要影响因素为耗电量。在真空冷冻干燥过程中，真空压强、隔板温度等因素以及样品性质均会影响三七活性成分的品质和质量。

本文系统研究了三七切片厚度、干燥机真空压强及隔板温度对PNS 和三七素两种化学成分的影响，并进行工艺优化，得出最佳工艺条件，以此为三七药材的加工提供技术指导和理论依据。

1 仪器、材料与方法

1.1 仪器

SCIENTZ-10ND 型真空冷冻干燥机，购自宁波新芝生物科技股份有限公司；Aglient 1260 型高效液相色谱仪，购自安捷伦科技有限公司；梅特勒AL-104型电子天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ5200E 型超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司；TU-1900 型双光束紫外可见分光光度计，购自北京普析通用仪器有限责任公司；3K15-高速冷冻离心机，购自德国Sigma 公司；S-4800 场发射扫描电子显微镜，购自日本日立公司；WFQ-510A 型傅里叶红外变换光谱仪，购自北京北分瑞利分析仪器有限责任公司；DGG-9123AD 型电热恒温鼓风干燥箱，购自上海森信实验仪器有限公司；SB-1100 型电热恒温水浴锅，购自上海爱朗仪器有限公司；UPT-I-20T型优普系列超纯水器，购自成都超纯科技有限公司。

1.2 材料

实验所用材料选取三年生的新鲜三七，17.59～21.23 g/个（除剪口），购于云南文山，经昆明理工大学杨野教授鉴定为五加科植物三七的干燥根茎。

1.3 试剂

三七皂苷R1对照品(批号:138902)，人参皂苷Rg1对照品(批号:140509)，人参皂苷Rb1对照品(批号:140651)，人参皂苷Rd 对照品(批号:140302)，人参皂苷Re 对照品(批号:140285)，三七素对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯，均购自美国Sigma-Aldrich 公司。

1.4 样品处理方法

1.4.1 工艺流程 样品处理工艺流程为：取适量新鲜三七清洗其表面杂质→切片→称重→均匀平铺于物料盘上→进行真空冷冻干燥。

1.4.2 真空冷冻干燥工艺的单因素试验 选取切片厚度（3、5、7、9 mm）、隔板温度（35、40、45、50、55、60 ℃）、真空压强（30、40、50、60、70、80 Pa）3 个因素，在不同干燥时间内测定PNS 及三七素的质量分数变化。

1.4.3 真空冷冻干燥工艺响应面试验设计 在单因素试验的基础上，采用响应面优化方法对三七冷冻干燥工艺进行优化。根据中心组合设计(CCD)的方法，以隔板温度(A)和真空压强(B)为影响因子，PNS 质量分数(T1)、三七素质量分数(T2)为响应值，设计两因素三水平的响应面试验，CCD 因素与水平如表1 所示。

表1 中心组合设计因素与水平Table 1 Central composite design factor and level

1.4.4 满意度函数 采用满意度函数[5]同时考察PNS 及三七素的质量分数。每一个考察指标（响应值）均按下列方程式转化为量纲为一的期望值，满意度函数的平衡尺度（d）范围为0～1，d=0 说明响应值

表2 冻干三七的考察指标和最低期望响应值、最高期望响应值及权重值Table 2 Investigation index, minimum expected response value,maximum expected response value and weighted value of freeze-drying panax notoginseng

1.5 指标测定

回归方程表明PNS 在100～1 000 μg/mL下线性关系良好。精密度相对标准偏差（RSD）值分别为4.30%、2.97%、3.62%、4.18%、1.96%；重复性RSD 值分别为2.73%、1.96%、1.87%、2.24%、2.28%。结果表明该方法的精密度、重复性及稳定性良好。

1.5.2 三七素质量分数测定 采用高效液相法测定

三七中三七素质量分数[7]，参考课题组前期工作[8]，色谱条件：分析柱 Welchrom C18(4.6 mm × 250 mm × 5 μm)，以水-甲醇(体积比为95∶5)作为流动相，流速为0.5 mL/min，样品进样体积20 μL，测得三七素的回归方程：

方程表明三七素在50～500 μg/mL 内线性关系良好，并测得精密度RSD 值为0.78% (n=6)；重复性RSD 值为3.58%(n=5)，稳定性RSD 值为0.94%。结果表明该方法的精密度、重复性及稳定性良好。

2 结果与分析

2.1 不同切片厚度对三七活性成分的影响

真空冷冻干燥过程中，PNS、三七素质量分数随切片厚度（真空压强及隔板温度一定）变化的规律见表3。由表可知，PNS 和三七素质量分数随着切片厚度的增加呈现相似的变化规律，两者均在切片厚度为5 mm 时，质量分数呈现最大值，分别为9.084% ±0.487%、1.872%±0.001%。因此，首先固定切片厚度为5 mm，再进行后续的干燥条件考察。

表3 切片厚度对三七主要成分的影响Table 3 Influence of slice thickness on the main constituent ofPanax notoginseng

2.2 不同干燥条件对三七主要成分的影响

2.2.1 隔板温度对三七活性成分的影响 图1 示出了固定切片厚度为5 mm、真空压强为55 Pa 时，在不同隔板温度下三七中有效成分的变化规律。由图可知，PNS 质量分数随着温度升高呈先升高后下降的趋势，当温度达到45 ℃时，PNS 质量分数出现最大值，为8.532%。由图1（b）可知，三七素质量分数随隔板温度升高同样呈现先升后降的趋势，当隔板温度为40 ℃时，三七素质量分数出现最高值，为1.872%。

2.2.2 真空压强对三七活性成分的影响 图2 示出了当固定切片厚度为5 mm、隔板温度为45 ℃时，在不同真空压强下三七中有效成分的变化规律。由图可知，真空压强为30～60 Pa 时，随着压强的增大，PNS 质量分数也呈逐渐上升的趋势；当压强为60 Pa时，PNS 质量分数出现最大值，为9.743%；当压强为50 Pa 时，三七素质量分数出现最大值，为1.815%。综合可得，当压强在50 ～60 Pa 范围内，三七活性成分相对较高，因此选择该区间进行响应面优化试验。

由上述单因素考察结果可知，干燥工艺各参数对三七中两种成分的质量分数均有较大影响，且各指标随考察因素（真空压强、隔板温度）的变化规律也不尽相同。因此不能以单一考察指标代表三七整体品质，可采用响应面优化的方法综合、系统地反映干燥工艺对三七整体品质因素的影响。

2.3 不同水平下三七活性成分变化曲线

分别将温度和真空压强水平（Level）取值−1.0、0、1.0，代入方程（1）和（2），绘制两个因素对PNS 和三七素两个指标的交互作用曲线，如图3、图4 所示。由图3(a)可知，温度-PNS 曲线在温度考察范围内呈现较大的上升趋势。不同的真空压强水平下，温度-PNS 曲线的形状特征改变较小。另一方面，由图3(b)可知，随着隔板温度水平的上升，压强-PNS 曲线逐渐上移，且总体形状保持不变。由此可知，对于PNS 而言，隔板温度是干燥过程中影响其质量分数变化的主要因素。

图1 三七活性成分随隔板温度的变化曲线Fig.1 Curve of the active constituent of Panax notoginseng varying with the clapboard temperature

由图4(a)可知，当真空压强水平为−1.0 时，三七素质量分数随着隔板温度水平的升高逐渐下降；当真空压强水平为0 和1.0 时，三七素-隔板温度曲线形状发生了改变，呈现先升后降的趋势。值得注意的是，在隔板温度水平较低的时候，真空压强水平对三七素质量分数影响不大；而当隔板温度水平较高的时候，真空压强水平的变化将显著影响三七素的质量分数，表明此时真空压强和隔板温度之间存在显著的相互作用。由图4(b)可知，在隔板温度水平为−1.0 和0 的时候，真空压强-三七素曲线较为平缓，表明此时三七素质量分数主要是受温度的影响。而当温度隔板水平为1.0 的时候，真空压强-三七素曲线呈现明显的上升趋势，表明在该温度水平下三七素质量分数受真空压强的影响较大。而3 条曲线呈现不同的变化规律，表明了温度和压强之间显著的交互作用。

2.4 CCD 试验结果分析及满意度分析

CCD 试验结果见表4，利用Design Expert 11 对数据进行多元回归拟合，建立以PNS 质量分数(T1)、三七素质量分数(T2)和总体满意度D为目标函数的二次回归方程，并对回归方程进行方差分析和显著性检验（表5～7）。

根据CCD 试验设计结果进行满意度分析。取表2中的y1l=6.5，y1h= 10.1，y2l=1.0，y2h=1.9。

图2 三七活性成分随真空压强的变化曲线Fig.2 Curve of active constituent of Panax notoginseng varying with vacuum pressure

图3 不同水平条件对PNS 质量分数的影响Fig.3 Effect of different level conditions on the mass content of PNS

图4 不同水平条件对三七素质量分数的影响Fig.4 Effects of different level conditions on the mass content of Dencichine

表4 CCD 试验设计及结果Table 4 Experimental design and results of CCD design

由表6 方差分析所示，该回归模型极显著（P＜0.01），说明三七素质量分数与各变量之间存在显著的线性相关，可以利用模型预测响应值三七素质量分数与变量之间的关系。其中一次项A-PRE 隔板温度不显著，说明A-PRE对三七素质量分数没有显著影响；B-TEM 隔板温度显著，交叉项AB显著，说明隔板温度和真空压强对三七素质量分数有显著交叉影响。二次项A2、B2显著。

由表5、表6 可知，模型极显著(P＜0.01)，失拟值不显著(P＞0.05)，说明该回归方程的拟合效果好，试验设计方案具有可操作性。A、B两个因素对响应值T1的影响效果大小顺序为：A＞B、对响应值T2的影响效果大小顺序为：B＞A。

表5 T1 回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of T1 regression model

表6 T2 回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of T2 regression model

表7 以总满意度D 为响应值的回归方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression with overall desirability D as response value

2.4.3 以总体满意度D为响应值的方差及响应面分析 为保证PNS 和三七素在干燥过程中最大程度保留，采用响应面和等高线对总体满意度D进行分析[10]。总体满意度D与真空压强(A)和隔板温度(B)的响应面分析结果见图5 所示。

交互效应的强弱可根据等高线的形状体现，圆形表示两因素交互作用较强。由图5(a)、5(b)可看出，压强和温度对总满意度的影响存在交互作用，且随着真空压强、隔板温度水平的增加，总体满意度D呈先增大后减小的趋势。

总体满意度D与真空压强（A）和隔板温度（B）的二次多项回归方程如下：

由表7 方差分析所示，该回归模型极显著（P＜0.01），可预测响应值总体满意度与变量之间的关系。将多响应值转化为单响应值即总体满意度D，根据软件Design Expert 11 的分析结果，利用响应面法求解D，得到理论最大总体满意度为4.353，代入式（12）～（14）中，求得此时对应的压强为56.9 Pa，温度为45.2 ℃，相应的PNS 质量分数9.77%，三七素质量分数1.76%。由表4 所示，以PNS 质量分数最大的响应值10.066%，所对应的三七素质量分数1.026%进行满意度计算，此时满意度为0.145；以三七素质量分数最大的响应值1.777%，所对应的PNS 质量分数9.506%进行满意度计算，此时满意度为4.141，均低于最大总体满意度4.353。表明满意度函数法能在多响应值之间取得均衡，适用于多响应值优化。

图5 总体满意度D 响应面图Fig.5 Response surface graph of overall desirability D

在最优条件下平行重复3 次试验，得出PNS 和三七素质量分数对应的总体满意度D值分别为4.315、4.264 和4.249 (平均值4.276)，与预测D值较为接近，证明该优化方法稳定可信。

2.5 SEM 表征

在优化工艺下制备冷冻干燥三七样品，并采用扫描电子显微镜(SEM)对不同干燥方式的三七及鲜三七(Fresh Samples, FS)的微观结构进行观察。结果如图6 所示。由图可知，FS 的SEM 图可见清晰的组织结构和排列有序的细胞。自然干燥(Room Temperature Drying, RTD)样品出现了一定程度的自然氧化导致的颜色加深。热风干燥(Hot Air Drying, HD)样品三七切片内部出现了严重组织收缩变形和细胞塌陷，宏观表现为较严重的氧化变色以及皱缩变形，样品硬度最大。而真空冷冻干燥(Freeze-drying in Vaccum,FD)样品由于在相对温和的干燥条件下操作，样品内部细胞或组织结构没有或发生了最小程度的热损伤，且未观察到较大程度的组织收缩和细胞塌陷，所以内部细胞或组织结构得以完好保存。

2.6 物料色度分析

比较不同干燥方式的样品与新鲜样品的色度值，样品色度分析结果通过色度仪直接测出，见表8。

图6 不同干燥方式下的三七样品SEM 图(100 kPa)Fig.6 SEM diagrams of Panax notoginseng samples dried in different ways (100 kPa)

由表8 可知，在不同干燥样品的色度测定结果中，HD、RTD 及FD 样品的亮度均显著高于FS 样品（P＜0.05），且三者之间亮度大小顺序为FD＞RTD＞HD，这与样品在干燥过程中被氧化而发生褐变的程度呈正相关。红绿值的大小顺序为FD＞HD＞FS＞RTD，黄蓝值的大小顺序为HD＜FD＜RTD＜FS。干燥后的FD样品与FS 样品的总色差差异极显著（P＜0.01），色度、红绿值和黄蓝值都远大于FS 样品，这是由于三七切片的干燥在冻结状态下完成，其物理结构和分子结构变化极小，组织结构和外观形态被较好地保存，说明采用真空冷冻干燥的三七切片样品的感官品质最佳。

表8 不同干燥方式下的样品色度分析Table 8 Chromaticity analysis samples under different drying methods

3 结束语

PNS 与三七素均为三七的次级代谢产物，主要分布在胞浆及细胞质等液体环境中，随着干燥环境的变化，细胞中液体质量分数和PNS 成分逐渐减少，导致PNS 活性成分降低；而三七素是一种水溶性非蛋白氨基酸[11]，在相对温度较高的条件下，氨基酸成分易受到破坏。真空冷冻干燥过程是在低温且基本隔绝空气的条件下进行，能够有效地保护三七活性成分、保持三七的色泽、药性和药味，同时可避免细胞的机械破坏，减少细胞内成分的损失[12]。本文研究结果表明，在真空干燥过程中，隔板温度和真空压强是影响PNS 和三七素质量分数的主要因素。通过Design Expert11 软件并结合满意度函数对真空冷冻干燥工艺进行综合分析，得出最佳工艺为隔板温度45.2 ℃、真空压强56.9 Pa。经过试验验证，该条件下PNS 及三七素平均质量分数分别达到9.77%、1.76%，与预测值相符，优化效果明显。该研究能够为三七药材的真空冷冻干燥工艺提供理论参考，同时对三七新型饮片的开发具有一定的指导意义。