解钾胶冻样芽孢杆菌的液态发酵培养基及条件优化

赫玲玲， 程顺利， 肖进彬， 王鹏晓， 方玉美

（河南省高新技术实业有限公司，郑州 450002）

钾是植物的必须营养元素，需求量较大，据土壤普查，中国有50%以上耕地土壤缺钾，每年需进口含硫酸钾、氯化钾等化学肥料进行补缺. 其实，中国耕地土壤中含钾量并不少，但95%的土壤钾存在于钾长石和云母这两类矿物中，不能被植物有效利用［1］. 胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）又称硅酸盐细菌、胶质芽孢杆菌，能分解钾长石、云母等硅铝酸盐类的原生态矿物质，使土壤中的不溶性K、P、Si等转变为可溶性元素供植物利用，释放可溶性钙、硫、镁、铁、钼、锰等中微量元素［2］，同时还可产生多种生物活性物质［3］. 胶冻样芽孢杆菌的解钾能力可以将植物难以利用的矿物钾释放为可以利用的有效钾［4］，该类菌种能合理地利用本土钾资源，改善土壤缺钾的现状［3-6］；其解钾能力与其在土壤中的丰度及活性有密切关系. 有些菌株同时具有固氮、溶磷和解钾三种作用［5］，不但可以增进土壤肥力，还可以有效提高化肥利用率［6］，已被广泛应用于农业、矿物相关工业、环境治理等领域.

本研究以胶冻样芽孢杆菌ACCC10013为试验菌株，对其液态发酵过程中影响活菌数的培养基成分、发酵工艺条件进行试验，以提高该菌株的单位活菌数为目标，期望获得适宜的液态发酵培养基配方及发酵工艺条件.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）ACCC10013（中国农业微生物菌种保藏管理中心）.

1.1.2 培养基

钾细菌培养基：蔗糖10.0 g、K2HPO40.5 g、酵母浸粉0.4 g、MgSO40.2 g、MgCl20.2 g、蒸馏水1 L、pH 7.0～7.2.发酵培养基：采用设计的培养基.

计数平板培养基：钾细菌琼脂培养基，即钾细菌培养基，添加琼脂粉18 g∙L-1.

1.2 方法

1.2.1 培养方法

活化培养：将装有胶冻样芽孢杆菌的冷冻干燥安瓿管开启后加入0.3 mL无菌水，使冻干菌种块溶化呈悬浮状，取菌悬液划线于钾细菌斜面培养基，待长出菌落后，挑取少许接种于钾细菌培养基中30 ℃液态培养24 h得到菌种活化液.

保存方法：活化后的菌种液用两种方法保存. 一是斜面保存法：用接种环取菌种活化液划线于试管斜面培养基上，30 ℃恒温培养24 h得到斜面菌落，密封保存于6 ℃. 二是甘油管保存法：40%灭菌甘油与活化后的培养菌液按体积1∶1配制装入安瓿管，在-80 ℃环境中保存.

生长曲线的测定：将甘油保存管胶冻样芽孢杆菌按体积1‰接种于钾细菌培养基中进行一次摇瓶培养，监测其生长趋势，绘出生长曲线；然后将上述一次摇瓶培养菌液按体积1%接种于钾细菌培养基中进行二次摇瓶培养，监测其生长趋势，绘出生长曲线.

摇瓶发酵培养：摇瓶发酵时培养基的装液量为20%. 上述二次摇瓶培养得到种子培养液，将生长到对数培养期的种子培养液按体积的2%接种到发酵培养基中，进行单因素试验和正交试验.

1.2.2 分析方法

菌量测定：采用平板计数检测每毫升培养液中的活菌数.

菌密度检测：经紫外-可见分光光度计测定吸光值.

pH值测定：经pH计和精密试纸检测.

1.3 试验设计

1.3.1 碳源单因子筛选 固定氮源酵母浸粉为0.4 g∙L-1，选取蔗糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜、玉米粉、麸皮等几种常见的工农业副产物作为发酵碳源进行筛选.

1.3.2 氮源单因子筛选 固定碳源，选取胰蛋白胨、牛肉膏、豆粕、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH4NO3作为发酵氮源进行筛选.

1.3.3 碳源含量优化 利用碳源单因素筛选中确定的最佳碳源，含量设计为5、10、15、20、25、30 g∙L-1，进行优化试验.

1.3.4 氮源含量优化 利用氮源单因素筛选中确定的最佳氮源，含量设计为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g∙L-1，进行优化试验.

1.3.5 生长因子的选择 因酵母浸粉营养丰富，可为胶冻样芽孢杆菌的生长提供更好的环境，选其作为生长因子，含量设计为0、0.1、0.2、0.5、1.0 g∙L-1进行优化试验.

1.3.6 无机盐含量优化 K2HPO4和MgSO4是发酵培养基中主要的无机盐，为胶冻样芽孢杆菌的生长提供主要的钾、磷、镁元素. 利用单因素实验确定的最佳碳源、氮源及其含量，设计K2HPO4为0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g∙L-1，设计MgSO4为0.2、0.5、0.8、1.2 g∙L-1，分别进行优化试验.

1.3.7 发酵条件优化 培养温度、初始pH是影响菌生长的主要条件. 利用单因素实验确定的最佳培养基培养，设计培养温度为30、32、34、37 ℃，设计初始pH为6.5、7.0、7.5、8.0，分别进行优化实验.

1.3.8 正交试验 通过单因素试验确定胶冻样芽孢杆菌的最佳碳源和中心水平，设计碳源含量、两种无机盐含量、发酵温度进行4因子3水平正交试验，寻找出较优发酵配方及发酵条件（表1）.

表1 正交实验因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.9 发酵罐试验 通过单因素和正交试验获得了较优发酵配方及发酵工艺条件，在此基础上用50 L液态发酵罐进行发酵试验，并监测发酵过程中的活菌量及菌密度.

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定结果

取甘油保存管菌种按体积1‰接种于钾细菌培养基中，30 ℃、180 r∙min-1摇瓶培养，每隔4 h取样一次，并以空白培养基为对照测吸光度（图1）. 0～12 h为适应期，12～40 h为对数生长期. 根据生长趋势选用24～32 h的培养液作为二次培养的种子菌液，按体积1%接种于钾细菌培养基中，30 ℃、180 r∙min-1摇瓶培养，每隔3 h取样一次，并以空白培养基为对照测吸光度（图2）. 二次培养适应期较短，生长较快，3 h后即进入对数生长期，根据生长趋势选用24～27 h的培养液作为发酵培养基的种子菌液.

图1 胶冻样芽孢杆菌一次生长曲线Fig.1 Primary growth curve of Bacillus mucilaginosus

图2 胶冻样芽孢杆菌二次生长曲线Fig.2 Secondary growth curve of Bacillus mucilaginosus

2.2 单因素试验结果

2.2.1 碳源 表2显示不同氮源对胶冻样芽孢杆菌液态发酵的影响. 在以蔗糖、甘油为碳源的发酵培养基中，发酵培养44 h后，活菌数相对较低，分别为0.4×107cfu∙mL-1、1.2×107cfu∙mL-1，且发酵后pH偏酸性；在以糖蜜为碳源的培养基中，活菌数较高，为12.2×107cfu∙mL-1；在麦麸为碳源的培养基中，活菌数为8.4×107cfu∙mL-1. 经分析可知，胶冻样芽孢杆菌在蔗糖、甘油等速效碳源［5-7］的培养基中生长过快，衰老也过快，发酵后的活菌数相对低，培养基也随之呈酸性；糖蜜中除了含有蔗糖，还含有泛酸和生物素等一些营养成分，在糖蜜为碳源的培养基中，菌体生长较好，发酵后的活菌数相对高；可溶性淀粉、玉米粉、麦麸为迟效碳源［8-10］，菌种在生长过程中利用缓慢，菌种的生长繁殖也相对缓慢. 综合菌量、成本等因素，确定糖蜜为最佳碳源.

表2 不同碳源对胶冻样芽孢杆菌液态发酵的影响Tab.2 Effects of different carbon sources on liquid fermentation of Bacillus mucilaginosus

2.2.2 氮源 表3显示不同氮源对胶冻样芽孢杆菌液态发酵的影响. 酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏属速效有机氮源，豆粕为迟效有机氮源，硫酸铵、氯化铵、硝酸铵为速效无机氮源［11-13］. 分别以酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、豆粕为氮源，固定添加量为2 g∙L-1的培养基中，发酵培养44 h后，活菌数均可达到108cfu∙mL-1以上，且发酵后pH偏碱性，其中以豆粕为氮源时活菌数最多，为5.3×108cfu∙mL-1. 以硫酸铵、氯化铵、硝酸铵为氮源的培养基中，活菌数相对较低，且发酵后pH偏酸性. 经分析可知，有机氮源发酵后活菌数明显高于无机氮源，且菌落生长状态更好. 由于以无机氮源发酵后培养液偏酸性，培养时需要添加的较多碱液才能维持pH平衡. 综合菌量、成本等因素，故确定豆粕为最佳氮源.

表3 不同氮源对胶冻样芽孢杆菌液态发酵的影响Tab.3 Effects of different nitrogen sources on liquid fermentation of Bacillus mucilaginosus

2.2.3 碳源浓度 图3显示不同碳源浓度对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响. 由图3可看出，当糖蜜在5～10 g∙L-1范围内时，活菌数随着碳源浓度的增加而增加；当糖蜜在10～20 g∙L-1范围内时，活菌数随着碳源浓度的增加而降低；当糖蜜在20～30 g∙L-1范围内时，活菌数随着碳源的增加而平缓. 当糖蜜为10 g∙L-1时，活菌数最高为4.9×108cfu∙mL-1；当糖蜜为20 g∙L-1时，活菌数降到108cfu∙mL-1以下，经检测，发酵菌液pH在6.0左右，为弱酸性环境. 故糖蜜选用10 g∙L-1.

图3 碳源浓度对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响Fig.3 Effect of carbon source concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

图4 氮源浓度对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

2.2.4 氮源含量 图4显示不同氮源含量对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响. 由图4可看出，当豆粕在0.5～1 g∙L-1范围内时，活菌数随着氮源浓度的增加而增加；当豆粕为1～2.5 g∙L-1时，活菌数随着氮源浓度的增加而相对平缓；当豆粕为2.5～3.0 g∙L-1时，活菌数随氮源浓度的增加而减少；当豆粕为2 g∙L-1时，活菌数最高为5.7×108cfu∙mL-1，比豆粕为0.5 g∙L-1时高出35.7%. 经检测，氮源浓度对发酵后培养液的pH 影响不明显，故豆粕选用2 g∙L-1.

2.2.5 生长因子 酵母浸粉富含蛋白质、氨基酸、肽、多肽、核酸、维生素及微量元素等营养成分，可为菌的生长提供更好的环境［9］，故选择酵母浸粉作为其辅助的生长因子. 由表4可以看出，在上述优化后的发酵培养基中分别加入不同浓度的酵母浸粉，活菌数随其浓度的增加有不同程度的增加，综合菌量、成本等因素，故酵母浸粉选用0.2 g∙L-1.

2.2.6 无机盐 图5 显示不同K2HPO4浓度对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响. 由图5 可知，当K2HPO4为0.5～1.5 g∙L-1时，活菌数随着其浓度的增加而增加，且当K2HPO4为0.3～0.8 g∙L-1时，活菌数增幅相对平缓；当K2HPO4为1.5 g∙L-1时，活菌数最高为7.2×108cfu∙mL-1，比K2HPO4为0.5 g∙L-1时高出33%.

图6显示不同MgSO4浓度对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响. 由图6可知，当MgSO4在0.2～1.2 g∙L-1范围内时，活菌数随着其浓度的增加而增加，当MgSO4为0.5～1.2 g∙L-1时，活菌数增幅相对平缓. 当MgSO4为1.2 g∙L-1时，活菌数最高为7.2×108cfu∙mL-1，比MgSO4为0.2 g∙L-1时高出33%.

表4 酵母浸粉浓度对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响Tab.4 Effect of yeast extract concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

图5 K2HPO4浓度对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响Fig.5 Effect of K2HPO4 concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

图6 MgSO4浓度对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响Fig.6 Effect of MgSO4 concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

2.2.7 温度 图7显示不同的培养温度对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响. 由图7可知，当培养温度在30～37 ℃范围内时，活菌数随温度的增加而增加. 胶冻样芽孢杆菌在37 ℃培养时生长速度较快，同一发酵时间内，活菌数较30 ℃时高出28.57%. 经分析可知，菌体在较高温度的发酵环境下易形成芽孢，有助于其在农业中的应用. 在发酵前12 h发酵温度保持在28～32 ℃，12 h后每2 h温度提高1 ℃，在温度升至36 ℃后维持该温度，直至形成芽孢，产率可达到95%. 不同的菌株其最佳生长温度不同［9］，但大都在30～37 ℃之间，若想得到最适宜的发酵温度，仍需进行优化实验.

2.2.8 pH 图8显示不同的初始pH对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响. 由图8可知，当初始pH在6.5 的弱酸性环境下时，活菌数相对较低，为2.9×108cfu∙mL-1；当pH 在7.0～8.0范围内时，活菌数随温度的增加而增加，且相对平缓；当pH在8.0弱碱性环境下时，活菌数最高为4.7×108cfu∙mL-1. 合适的初始pH值能够缩短菌体的调整期［14］，加速菌体繁殖［15］. 故胶冻样芽孢杆菌适宜在pH 为7.0～8.0的中性偏碱性条件下生长.

2.3 正交试验

为了确定较优培养基及其发酵条件，在单因素试验的基础上选取较窄的浓度范围，进行4因素3水平正交试验［14］. 从直观分析表得知：这4 因素的主效应排序为培养温度>MgSO4>K2HPO4>糖蜜；F 比值分别为1.596、1.577、0.760和0.067. 温度对胶冻样芽孢杆菌的活菌数影响最大，其次是MgSO4浓度，而碳源糖蜜浓度对其影响不显著，如表5、表6. 确定出较优发酵培养基配方为：糖蜜12 g∙L-1，K2HPO40.8 g∙L-1，MgSO40.3 g∙L-1，豆粕2.0 g∙L-1，酵母浸粉0.2 g∙L-1，MgCl20.2 g∙L-1；发酵条件为培养温度37 ℃，初始pH 7.0～8.0.

图7 温度对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响Fig.7 Effect of temperature concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

图8 pH对胶冻样芽孢杆菌菌量的影响Fig.8 Effect of pH concentration on the quantity of Bacillus mucilaginosus

表5 正交试验直观分析Tab.5 Visual analysis of orthogonal experiment

表6 正交试验方差分析Tab.6 Analysis of variance of orthogonal test

2.4 50 L发酵罐发酵

通过单因素和正交试验选出了较优培养基配方和发酵工艺条件，在此基础上，进行50 L 发酵罐试验［15-18］. 发酵时接种量为5%，pH控制在7.0～8.0，溶氧控制在20%左右，发酵周期为52 h，每隔8～12 h取样，采用平板计数法测菌量，并以空白培养基为对照测吸光度. 由图9 可知，当发酵至36 h 时，活菌数最高，为1.85×109cfu∙mL-1，随后活菌数逐渐下降. 当发酵时间在0～36 h范围内时，吸光度与活菌数的增长趋势保持一致；当发酵时间在36～44 h范围内时，活菌数有明显下降，而吸光度下降较为平缓. 从发酵罐发酵结果可知，在本实验中优化的培养基及培养条件下，该菌株未补料单批次的发酵培养时间在36 h附近，即可放料收集菌体，此时监测的罐体内溶氧不再明显变化，罐内的可用碳、氮源物质相对缺乏，菌体生长缓慢，甚至芽孢不能正常萌发和生长繁殖. 但若需一定的芽孢数，还需微调发酵条件，并监测芽孢形成率及芽孢数，以便达到生产要求（图9中吸光度为样品5倍稀释后所得数据）.

图9 发酵罐发酵过程中菌量及菌体密度监测曲线Fig.9 Monitoring curve of bacteria quantity and density in fermentation process of fermenter

3 结论与讨论

3.1 结论

由于胶冻样芽孢杆菌菌株的来源、保存环境、研究方向等不同，其培养基配方及发酵条件与现有报道文献存在一定的差异［12］. 王金玲［13］等进行条件优化后发酵活菌数达到3.47×108cfu∙mL-1；吴向华［14］等进行条件优化后进行了发酵罐实验，活菌数达到9.58×108cfu∙mL-1.

通过单因素试验和正交试验确定较优发酵培养基配方及工艺条件为：糖蜜12 g∙L-1，K2HPO40.8 g∙L-1，MgSO40.3 g∙L-1，豆粕2.0 g∙L-1，酵母浸粉0.2 g∙L-1，MgCl20.2 g∙L-1；发酵温度37 ℃，初始pH 7.0～8.0；摇瓶发酵培养44～46 h，活菌数可达到7×108cfu∙mL-1，较优化前显著提高；在此基础上用50 L发酵罐进行中试发酵，培养36 h左右即可收集菌体，活菌数可达到1.85×109cfu∙mL-1，较王金玲［13］、吴向华［14］等有一定程度的提高.

如需要最佳发酵培养基各成分浓度及其发酵工艺条件，可进一步进行响应面法设计试验［18］. 优化后的培养基，在保证营养充足、提高活菌数的条件下，利用了较为廉价的原料，并且缩短培养周期，降低生产成本，为后期的工业生产提供技术参考.

3.2 讨论

由于胶冻样芽孢杆菌功能广、应用潜力大，一直是国内外研究的热点. 目前对其应用主要集中在生物钾肥、污水处理、生物冶金等方面［17］，相关研究的切入点可从以下方面入手.

1）活菌剂制备：胶冻样芽孢杆菌作为微生物菌肥的主要功能菌［19］，可将其制成活菌制剂. 采用低温多级干燥制粒新工艺，相比传统离心喷雾干燥生产工艺，进口温度和出口温度低，更好地保留了生物活性，而且一次性获得水分分散颗粒剂产品而不是粉剂产品［7］. 胶冻样芽孢杆菌与秸秆生物质炭进行复配，可延长其存活时间，提高其对土壤的解钾效率［20］.

2）解钾能力提高：有些研究者将胶冻样芽孢杆菌经过UV诱变处理，以期获得一些较出发菌株的解钾能力有所提高的突变株，但这些突变株在生产应用中易发生回复突变，需不断进行复壮诱变［21］.

3）功能开发：胶冻样芽孢杆菌因其荚膜多糖还是一类良好的微生物絮凝剂，对重金属Pb2+有吸附作用.菌株MY6-2絮凝剂对100～500 mg∙L-1的Pb2+吸附活性［22］在80%以上；胶质芽孢杆菌G14对重金属铬是一种有效的微生物吸附剂，在优化后的条件下，最大吸附量［17］为257 mg∙L-1. 胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）K02菌株制得的微生物吸附剂对重金属离子Pb2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+和Cr3+均有吸附作用［23］.