实验动物血清胶冻样成因分析及消除方法探索*

饶玉良 马淑兰 张亚东 王见之 王 浩 严钰锋

复旦大学基础医学院,上海市 200032

动物血清是常用的实验材料,血清质量往往决定实验数据的准确性和科学性。动物血清制备常出现一些异常情况,如血清析出,但呈胶冻样血清。胶冻样血清对血清学检测过程和数据造成很大影响,严重干扰实验结果。减少血清胶冻样的形成,对涉及血清学检测的实验都具有重要意义。本文基于血液凝固机制,重点分析实验动物血清胶冻样的成因,并探索消除血清胶冻样的系列方法,减少血清胶冻样的形成,对于血清学检测具有重要的意义。

1 动物血清及其制备

血清学检测不同指标可反映动物生理和病理状况,对疾病检测诊断、动物模型复制、疾病机制研究、治疗效果评价等,具有重要意义。

1.1 血清组成成分 血清呈淡黄色,为血液凝固后析出透明液体,不含纤维蛋白原,能维持血液黏度、酸碱度、渗透压等。血清成分复杂,包含水、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、甘油三酯、总胆固醇、多肽等,还含有尿素氮、肌酐、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。血清成分及含量常常变化,与供血动物性别、年龄、生理、病理和营养状况等有关。凝血时血小板释放大量物质,凝血因子也都发生变化,血清成分发生改变。纤维蛋白原活化为成纤维蛋白,与血浆显著区别是血清无纤维蛋白原。动脉血和静脉血的血清成分上也会有区别。

1.2 血清析出过程 血液凝固有三个过程:凝血酶原激活物形成、凝血酶形成、纤维蛋白形成,最根本的是血浆可溶性纤维蛋白原活化成不可溶的纤维蛋白。血液样本在未加抗凝剂的情况下,血小板破裂释放凝血激活酶,在系列凝血因子参与下,凝血酶原活化为凝血酶,纤维蛋白原活化为纤维蛋白单体;凝血酶激活凝血因子ⅩⅢ为活性凝血因子ⅩⅢa,纤维蛋白单体聚合为不溶纤维蛋白多聚体,交织成网状,血细胞、血小板被网罗其中,血凝块形成,淡黄色透明的血清析出。

1.3 血清制备方法 根据实验动物、采血部位和采血要求的不同,采血方式方法也不同。若采用一次性注射器从动物血管中吸出血液后,取下针头,将血液沿着离心管壁缓缓注入离心管,离心管室温静置2～4h,或37℃水浴或恒温箱预处理0.5～1h。待血清析出后,3 000～4 000r/min离心10min,上清即为澄清透明的淡黄色血清。

2 血清胶冻样物质的成分分析

凝血是复杂的反应过程,最终表现为血凝块形成和血清析出。采血后血液未完全凝固就离心,使红细胞、活化血小板离开纤维蛋白网,红细胞、活化血小板沉积,而纤维蛋白因缺乏磷脂表面,无法收缩沉积,且其比重较小,离心后留在血清层,形成胶冻样[1]。

血清胶冻样物质的具体成分目前还未见相关研究报道。根据血液凝固和血清析出的机制推测,胶冻样物质可能是胶原蛋白、纤维蛋白原,或活化但尚未收缩的纤维蛋白。部分胶冻样血清是因供血动物过于肥胖、脂肪过多,纤维蛋白及脂肪过多聚集于血清,而形成胶冻状血清[2],显示血清胶冻样的形成与脂肪可能有关。

3 血清胶冻样的成因分析

实验动物采血制备血清时,会遇到有血清析出但血清呈胶冻样不能吸出的现象,也曾遇到血清澄清透明但吸出后变成胶冻样的现象。动物血清呈胶冻样主要包括以下原因。

3.1 血液静置时间短 采血后,血液在离心管或采血管内启动凝血过程,纤维蛋白原在凝血酶作用下活化为纤维蛋白,纤维蛋白单体交联,交织成不溶的网状纤维蛋白多聚体,血细胞被网罗于内,血凝块形成,血清析出。采血后放置时间不够长,血液凝固不完全就离心,易形成胶冻样血清[3]。

3.2 温度不合适 血液样本放置的环境温度也会影响血清析出。冬季气温低,酶活力低,血液中纤维蛋白原不易充分活化、成网、沉淀,易导致胶冻样血清形成,故冬季胶冻样血清更易出现。环境温度过高,也可能因血液水分挥发,血清缺水而形成胶冻状[4]。

3.3 食物和营养状况的影响 动物进食后,机体各器官功能活跃,血液成分含量变化较大,进食后采血更易出现胶冻样血清。采血时间宜在进食前或进食2h后,畜禽宜禁食8h(空腹)后再采血,常早晨或午后采血。禽类24h内喝水太少,血清也不易析出。常高蛋白质高脂肪饮食,动物容易营养过剩、高血脂,血液中纤维蛋白和脂肪过多,易出现乳白色胶冻样血清。

3.4 动物品种的影响 实验动物常用家兔、大鼠、小鼠、豚鼠、蟾蜍等,也会用到牛、猪、狗、鸡、鸭等。鸡血清更易出现胶冻状[4],鹅、鸭类本来就血脂高,易形成胶冻,可以采前多饮水来改善。 实验动物性别、年龄、生理、病理和营养状况等因素影响血清构成成分及含量,不同的实验动物个体血液状况不同,有些更易形成胶冻样。

3.5 采血部位的影响 不同的采血部位,也可能影响血清胶冻样的出现。动脉血和静脉血成分不同,血清析出也会有影响,因此,动静脉采血部位对血清制备也有影响。不同品种动物采血部位不同,也会有影响。猪的前腔静脉和耳静脉均可采血,前腔静脉通常用于大批量采血。禽翅膀内侧腋下静脉和心脏均可采血,翅膀内侧腋下静脉常用,心脏采血多见于对淘汰禽检测或技能竞赛。牛颈静脉和尾根静脉可采血,奶牛多尾根静脉采血,羊颈侧静脉采血常用。

3.6 采血器材的影响 使用一次性的真空采血装置采血,若采血后活塞未打开一定空隙,血清便不容易分离出来;采用注射器采集血液后,如果未取下针头便快速将血液推入离心管,易导致溶血及血清浑浊;若采用抗凝管采血,则会影响血液凝固血清析出。玻璃试管血清析出的效果比塑料离心管好,胶冻较少。若采用促凝管采血,管内促凝剂会加速血液凝固,更快更好地获取血清。采血量以采血管容积的1/3为宜,不宜超容器2/3。大、中型实验动物全血量不少于5mL。为保障充足的血清量,大、中型实验动物析出血清不宜少于1mL,禽及宠物血清量不宜少于0.5～1mL。采血量少、采血断断续续、抗凝管采血,易导致血清量不足或胶冻样。

3.7 影响因素 动物实验中,尤其介入性手术操作,易引入抗凝物质,对血清会产生影响。采血部位酒精未完全挥发时采血,酒精可能渗入血液, 血清更易出现胶冻样。 疾病也容易导致血清呈胶冻样。浆细胞疾病(如多发性骨髓瘤等)会引起浆细胞异常增殖,单克隆免疫球蛋白增多,异常免疫球蛋白或片段剂量过量而沉淀,可导致组织变性以及淋巴细胞浸润,引发器官功能障碍。免疫球蛋白浓度过高,增加血液黏稠度,导致广泛病理损伤。多发性骨髓瘤患者血管内皮细胞生长因子和组织因子等水平升高,大量M蛋白与纤维蛋白原相互作用, 损伤纤维蛋白的聚合作用,引起患者血清易出现胶冻样[5]。

4 血清胶冻样的消除方法

4.1 加强动物免疫和科学饲养 根据动物种类和免疫要求,科学规范免疫,确保实验动物健康。科学合理均衡饲喂,确保动物营养均衡和生理指标的正常。对于特殊模型动物,按照建模要求科学制定建模方案。

4.2 严格注意采血时机、温湿度和放置时间 通常早晨或午后,动物空腹或禁食8h后采血,尽可能减少摄食对血液的影响。血清制备与环境温湿度关系密切。采血过程中注意样品保温,尤其冬季,采样时可在采样箱内放置保暖袋,温度控制在37℃左右。采样后将样品37℃培养箱中放置1～2h,待血清析出后,3 000～4 000r/min离心10min。若离心前血清析出良好,离心后装入离心管内形成凝胶,可在不影响后续实验的前提下,放置在56℃水浴锅或金属浴锅中加热0.5h,促进纤维蛋白凝结[6]。若时间到仍有凝胶,可适当延长加热时间。

4.3 采血操作科学规范 根据动物种类和血清要求,选择合适采血方式、采血部位和采血器材。使用一次性真空采血器采血后,将采血器活塞尽可能拉到最大刻度,套上针头帽,采血器针头朝上自然倾斜30°～45°角静置[7],血清自然析出,血液样本避免阳光直射[8]。离心过程时,放置在离心机转子外圈离心孔中也能在一定程度减少胶冻血清的出现。

4.4 适度混匀有利于血清形成 动物采血后,颠倒混匀血液样本,再静置于室温或孵育箱,待血液完全凝固血清析出后再离心。若采血后样本直接静置,不颠倒混匀,血液样本的细胞成分自然沉降,血液凝固,血液细胞成分和血清分离,有时也不易通过离心获得合格血清。

4.5 其他解决方案 动物实验中,如出现完全胶冻样血清,可采用无菌针头或移液枪枪头将胶冻样物质挑出,再静置或离心,血清便再次分离出来。若某采血部位分离的血清易呈胶冻样或混浊,更换采血部位也可得到理想血清。

5 讨论

在现代科学研究中,动物血清是常用的实验材料,血清质量的好坏往往直接影响实验过程和实验结果。动物血清制备过程中,常因血液静置时间不够长、温湿度因素、动物种属、个体差异、饮食和营养状况、疾病状况、采血部位、采血器材、药物因素等影响,血清可能呈胶冻样,或完全凝固没有血清析出,必然会影响血清学试验及血清成分检测。血清质量是血清学检测的前提,因此,对血清胶冻样成因分析和探讨消除办法,对于血清学检测具有重要的意义。实验动物血清广泛应用于各种血清学检测,不仅适用于科学研究和实验教学,还适用于动物疫病检测、免疫效果评价等多种场景,在传染性疾病防控、畜牧养殖业等广泛应用。因此,分析血清胶冻成因,探索消除胶冻样血清的方法,减少血清胶冻样的形成,具有重要的现实意义。

本文通过对血清胶冻成因的系统分析,梳理归纳血清胶冻的主要成因,并据此提出消除胶冻的相应解决方案,对动物实验中减少胶冻样血清有积极作用。然而,由于动物个体差异等因素,以及还未完全掌握血清胶冻的成因等多方面原因,还没有真正意义上完全解决血清胶冻的形成,还有待后续继续研究机制和不断积累解决方案。