医学实验动物采血方式及检前因素对生化指标的影响*

张金月 惠 敏 道力给艳 张子英 张 楠 曹晓东 朱晓伟 韩 帅

内蒙古医科大学,内蒙古呼和浩特市 010110

血液检验是临床中最常见的检测项目之一,血液生化结果对于临床的诊断和治疗具有重要的参考意义。饲料半衰期测量、药代动力学研究、医学免疫学指标值检验、病源致病力等有关指标的评定均可通过血液测定。血液生化检测项目的样品类型分为全血、血清/血浆,检测指标多达70余项[1]。

小型实验动物的采血方式主要有眼眶静脉丛采血、尾静脉采血、心脏采血、腹主动脉采血、耳缘剪口采血、毛细血管采血等。大型实验动物采血多为静脉采血。不同采血方式各有优缺点,依据实验要求选择合适的采血方式至关重要。最理想的采血方式既要操作简便,又要缓和实验动物状态,使血液质量得到保证;然而每种采血方式在具体实施中,都难免会受到各种操作因素的影响;一定时间内不合理的多次采血,会使动物生理和情绪发生变化,且具有累积效应,使血液生化指标发生变化,这与试验数据的有效性、准确性有直接关系。因而,依据实验需求与采血特性开展有针对性的挑选极其重要[2]。采血方法、血样处置方式、采血过程等多种因素均可影响血液生化检测结果。实验动物采血的具体操作要考虑多种因素,如动物福利、血样要求和采血频次等,选择合适的采血方式,既保证得到高质量的血液样本,又能减少对实验动物的伤害。本文对实验动物常用的采血方法以及影响血液生化指标的一些因素进行总结,为检测者和实验者提供参考和帮助。

1 实验动物微量采血方式

连续微量采血可在无须处死动物的情况下追踪血样生化指标的动态变化,相比于一次性大量采血可有效减少实验动物的使用量。

1.1 舌下静脉采血 适用于大小鼠,对舌肌等细胞损伤比较小,痊愈快,可不断采血,但是必须在麻醉状态下开展。

1.2 尾部采血 适用于大小鼠,包括尾尖采血、尾静脉取血和尾静脉穿刺采血,可用于全程动态检测,如血常规检测、血糖监测等。尾尖采血应注意防止剪尾太长和尾端断端的止血难题,一次采血量为0.2mL,采集的血液是动静脉混合血,适用范围较小。尾静脉取血除操作简便外还具备损害小、痊愈快、副作用少、血液不易受环境污染等优点。尾静脉穿刺采血大鼠一次采血量0.15mL[2],因注射针伸缩速率不易操纵会导致毛细血管收缩、血液外溢,可使用真空采血管开展采血,从而避免因为伸缩注射针速率不均而引起的试验失败风险。

1.3 眼眶采血 适用于大小鼠,速度较快,抽血量较多,规模试验适用于此方法。小鼠单眼眶采血组织修复期为 10d 左右[2],多次眼眶下取血会引起眼眶细胞损伤、自主神经系统性紊乱等,比较严重状况也会导致死亡。数次采血时要重视眼部保养从而减少并发症的发生。

1.4 颈静脉取血 适用于啮齿类动物如大鼠、小鼠等以及马、牛、羊等。采血量多,品质高,但部位比较深,规定操作人员了解实际操作技术以及头颈部解剖结构,防止不断试插而造成大量出血。颈静脉取血可采集约0.5mL的血量[2]。使用颈静脉方法采血一般无麻醉剂,可能会由于皮下组织穿针造成皮下出血点,体现为淤血。规定采血量多,采血部位损伤小,麻醉后也可选用一次性真空泵采血,但长时间麻醉易使实验动物的中枢神经系统遭到破坏。现阶段采用的新型的套管技术能够填补数次入针上的不足,在减少小鼠应激同时持续收集大量高品质血液。颈静脉取血一般应用于药代动力学的研究,颈静脉套管技术的实施解决了连续数次采血造成的机体损伤问题,一次取血可达全身上下循环血量的15%[2]。

1.5 隐静脉采血 常用于大小鼠、兔的少量血液采集,血管部位浅,易穿刺,应激反应小,血液品质高。

1.6 下颌静脉取血 常用于小鼠的采血,其创口小、采血量多、恢复快,但是入针点比较难掌握。

1.7 大动静脉埋管 常用于大鼠的采血,此方法适用于实验动物的持续采血,为数次微创采血带来了新的方向,但是埋管操作繁杂,中后期需维护保养。

1.8 其他实验动物采血方式 兔的常见采血部位包括耳和心脏。兔耳耳型大,动静脉分布明显且有规则,耳缘静脉采血方法一般可采血1～2mL;兔的胸腔由纵隔分为互不相通的两部分,为心脏采血提供了方便,一次可采血15～20mL。猴常用静脉采血法,也可根据所需血量选择不同取血部位,即少量(1mL以下)在后肢隐静脉采血;中等量(3mL左右)在股静脉采血,大量在麻醉状态下进行心脏采血,体重2～4kg的猴子可取血100～150mL。豚鼠可采用心脏采血,将豚鼠麻醉后仰卧固定,观察并用指尖触摸到豚鼠胸部心跳最明显部位,用针头插入胸壁后稍向右下方刺入,可重复多次采血,成年豚鼠每周采血量不应超过10mL[3]。

2 检前因素对血液生化结果的影响

对实验动物来说,年龄、性别、饮食搭配、长期服用药物、精神状态及运动状况、采血体位、采血方式、采血技术等均是影响生化检验指标的因素,通过制定相应的规范操作方法可最大限度地减少检验偏差。

2.1 个体因素

2.1.1 生长发育对血液生化指标的影响。幼年时期处于动态发育过程,正常成年实验动物的参考范围与幼年时期的某些生化指标不同。如:幼年动物骨骼发育代谢活跃,促使成骨纤维细胞分泌乳酸脱氢酶(ALP)增加,因此幼年动物体内的ALP值比成年的相对值要高。幼犬幼猫的某些生化指标会比成年时期小,如有文献报道2日龄身心健全的幼犬血糖浓度比成年犬要小;但8日龄犬的血糖浓度高于成年犬[4]。幼时动物机体脂肪含量偏少,所以其血清肌酐浓度值稍低。幼犬的肌蛋白激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)高于成年犬,发育到7个月龄时下降到成年后范围内。

2.1.2 性别对血液生化指标的影响。许多研究表明,年龄因素和性别因素也是影响动物血液生化指标的因素之一[5]。Obese等人通过研究豚鼠,认为年龄、性别、品种均会影响豚鼠的血液生化指标[6]。不一样性别的实验动物体内性激素水平也不一样,而且某些种类实验动物的成年雌激素水平会在月经周期内有明显变化,幼犬4月龄后雄性动物的5-羟色胺水平开始高于雌性动物[7]。

2.1.3 生物节律及环境对血液生化指标的影响。哺乳动物的昼夜节律活动差别十分明显,实验动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬等都有各自的生活习性和昼夜节律活动。节律会影响到动物的新陈代谢、血液成分。Olanrewaju等发现,光照不仅影响生理应激指标如皮质酮和葡萄糖的浓度,还影响着体重和部分血液生化指标。长期处于黑暗环境会促进褪黑素的分泌,降低血糖浓度[8]。血液中的胆固醇、血钙、尿素氮等指标也会受昼夜节律的影响。

不同海拔地区、生长环境也会影响血液生化指标。辛迪在实验中发现低氧环境下对大林姬鼠血液生理生化指标、呼吸频率、活动量、取食量、取水量以及心脏、肺、肝、肾等脏器功能都有影响[9]。长期生长在海拔3 000m高原环境下的高原蕨麻小型猪,适应了当地氧分压低、紫外线照射强、寒冷昼夜温差变化大的自然环境特点,机体功能发生了适应性的变化,在某些血液生理生化指标上与一般巴马小猪存在差异[10]。

2.1.4 其他。饮食搭配会对血液中如葡萄糖(GLU)、三酰甘油(TG)、ALP和磷等多种化学物质浓度造成影响。在采血前1d进食含高蛋白的食物,会导致尿素氮(BUN)和血尿酸(UA)浓度较高[11]。进食后血中的脂类尤其是TG浓度升高,可引起血清蛋白呈奶白色样混浊,对生物化学测量产生影响,可能导致总胆汁酸、蛋白、钙、磷的测量结果较高,而胃蛋白酶的测量结果稍低。动物禁食时间超过16h,常因饥饿过度而降低血清蛋白(ALB)和GLU浓度值。另外,实验动物的饮水缺乏也会对各项生化指标造成影响。

应激反应会影响动物的神经中枢,造成体内内源性糖皮质激素代谢增加,引起血象改变,进而引起血清蛋白、乳酸菌、血脂浓度值升高的非酯化反应[12]。因此,要注意操作方法,避免实验动物出现应激反应。

强烈的肌肉运动对新陈代谢有显著影响,使得血清蛋白非酯化反应油酸快速降低,继而升高。剧烈运动时可导致呼吸加深加快,使CO2分压降低,pH值升高。运动会使心肌细胞耗氧量增加,从而促进心肌细胞酶的释放,造成血清蛋白(ALB)、天冬氨酸谷丙转氨酶(AST)、LDH 和 ALP 的浓度值上升。因此,在采血前最好进行30min的休息,以减少动物剧烈活动对检查结果的影响[13]。

2.2 操作因素 当体位改变时,血液循环与体液循环之间的平衡会发生改变,从而使细胞成分和大分子物质在血清蛋白中的浓度值发生改变。小型实验动物的采血体位最好是平举,四肢向外伸展;而大型实验动物则需要平躺在地面上,也可以平躺在诊床上。Ilies等人利用定性和定量分析蛋白质得出,血液收集管的类型和所使用的抗凝剂在一定程度上会影响血液中蛋白和肽数量的变化。血细胞内、外各种成分存在浓度差,因此标本溶血会对检测结果产生影响。造成标本溶血的主要原因有:穿刺前消毒乙醇未干、注射针或采血管不洁、采血速度过快、猛烈摇晃采血管、抗凝剂和血液比例不合适等。溶血对于血液测量指标值所造成的影响包括:(1)红细胞中浓度较高的成分逸出,使测量结果偏高,如LDH、AST、K+和CK等。(2)红细胞成分进入血浆后,会与血清蛋白中的磷酸酯酶发生水解反应,如血细胞鞘磷脂进入血浆后引起检测物质浓度值发生改变,导致血清蛋白无机磷浓度值显著升高。(3)血红蛋白本身浓度会使光学检测受到影响,例如由重氮试剂法测定溶血症可引起总胆红素显著上升[14]。上述三类影响同时存在于溶血症样本中,可互相影响。

影响实验动物少量采血血液品质的另一关键因素是采血频次。血液的采集对生物都有一定刺激作用,会对测试指标产生影响。1d 内数次开展尾端采血会引起副作用:如血液皮质酮浓度上升等,但当采血工作频率减少到每日1次时,血液皮质酮浓度值则不会产生以上影响[15]。在大小鼠尾部采血实验操作中,如要检测血液皮质酮浓度值指标值,需在24h之后进行2次取样。应依据药物和有害物质的特性和新陈代谢特性明确采血时间间隔,提升测试数据信息的真实性和精确性。

2.3 样本处理方式 混匀是采血后的一个重要步骤,通常将采血管混匀3～8次,且应遵循尽快送检原则,在最短的时间内送到实验室。离心后室温放置半小时,总放置时间最好不超过3h,避免管中内容物的震荡,防止标本溢出或污染。标本检验中要注意避免阳光直射,以4～25℃的适宜环境温度为宜,根据保存温度不同进行室温、低温或保温处理。杨艳茹等人认为,生化检验结果受采血方法不同、样本保存方式不同等因素影响较大,肝脏功能指标中的总蛋白(TP)、直接胆红素(DBL)、总胆红素(TBL)、AST/ALT与保存温度和时间的关系较为密切,且样本保存时间越长、温度越低,测定AST/ALT的结果就越不准确[16]。

徐公民的研究结果认为,送检时间15min和2h的患者血液样本生化指标除血糖值外,其他血液生化指标差异不大[17]。田玫玲等人的研究认为,血液中的各种生物化学指标都会因为血液样本的放置和处理方式而发生变化,采集到的血液标本如果放置时间过长,就会造成血液中某些生物化学成分的改变[18]。朱科燕等人研究发现,大鼠采血后离心前放置时间延长,血清天门冬氨酸氨基转移酶、肌酸磷酸激酶、乳酸脱氢酶等升高,可导致血清血液中葡萄糖含量降低[19]。

很多检查项目在正式检测前都要做准备处理,而及时准确的样本处理是每个检测者必须了解遵从的,比如在测定血糖浓度时要及时将血清蛋白分离出来,这样才能避免糖酵解反应影响试验结果;电解质溶液的测量也要及时将血清蛋白分离出来,尤其要注意K+的测量,避免体细胞内的K+迁移到体细胞外。生物化学实验用水水质的好坏直接关系检验结果的准确性,应依据仪器设备具体需要提供符合要求的相应水质。实验试剂应选用合乎政策法规标准生产厂家的商品,同时也要查验其准字号与生产批准文号等标识。选购回来后应做科学实验以认证产品质量要求是否相符,一旦认同并投入使用,勿随便拆换。实验试剂应按照要求妥当储存,由专职人员存放,保证有效期内应用,以确保实验试剂的稳定性。

2.4 给药因素 麻醉剂因具备可减少穿刺术出错、缓解细胞损伤和减轻动物痛苦等明显优点而广泛应用于临床试验中,但麻醉刺激动物产生一些生理与行为的变化,包括造成血流动力学转变、血液血胺等应激反应指标上升、血糖含量改变以及影响激素类药物等物质新陈代谢等,以上部分由麻醉剂造成的数据信息误差可以通过设置对照实验来校准[15]。因而,必须在合理分辨麻醉剂对科学研究指标的实际危害后,再选择是否需要麻醉剂。

医学检验结论错误(非生理性异常值)的重要因素之一是药物进入体内所引起的化学物理变化。药品自身或其他代谢物能够对有机化学的检测流程造成影响。药物可以通过自身的物理特性影响指标值的检测,如药物本身具有色彩或能发出荧光,或由于药物的物理性质,如强氧化性、与蛋白融合成复合物、抑制酶的作用等;还可以通过其生理作用、药理和毒理功效影响生化检测,如杜冷丁类药物会引起唾液淀粉酶和总胃蛋白活性升高。很多药品的不良反应使肝肾功能、造血机能发生变化,造成检验结果出现异常。这类危害一旦出现,即便断药也难以恢复。如大量使用青霉素及抗癌化疗药时,常对肾脏功能造成危害,出现尿蛋白、造成肾小球及肾小管损伤。有许多种药品,如罗红霉素、对氨基水杨酸等可使肾脏功能出现异常。长期性打点滴会稀释血样,导致一些检验结果偏低;由于静脉输液时高浓度药品进入到血液中,使很多检验结果产生巨变,比如在静脉输液葡萄糖水或甘油果糖后,采血所测出的血糖指标会受到影响[20]。输液会使血液稀释,且输注成分可能干扰检验结果。最常见的干扰项目是葡萄糖和电解质,因此要尽量避免在输液过程中采血。

3 实验动物福利与采血

目前,实验动物福利的国际公认的3R原则和5项自由原则,为动物实验研究提供了一个伦理框架[21]。在实施临床试验时,应综合考虑采血方法对实验动物造成的不良影响,在3R原则的基础上,尽可能地使用对实验动物机体损伤最小的采血方法,以保障实验动物的权利。有研究表明在小鼠的采血过程中,尾静脉切割收集到的血液与颈静脉穿刺相比会容易产生溶血症,但这两种方式对小鼠造成的损伤类似,因此在相关的科学实验中,如研究血液变量等实验中,颈静脉取血更适合进行多次持续采血[22]。

4 小结

总之,实验动物采血要依据不同的实验目的,所需检测的参数,实验研究的要求来确定血液样本的特性。实验设计时应按照采血的具体要求,选择相匹配的采血方式及采血频率,灵活运用采血专业技能,确保实验的有效开展,与此同时最大限度地减少人为操作对血液样品所产生的影响。