润肤止痒乳膏对特应性皮炎患者及小鼠模型皮肤屏障功能影响研究

陈志伟，张亚男，陈信春

（1.温州市中西医结合医院，浙江温州325000；2.浙江中医药大学第二临床医学院，浙江杭州310000）

皮肤屏障功能的完整性与特应性皮炎（AD）的严重程度有着密切联系，润肤止痒乳膏对AD小鼠模型皮损有很好的改善作用[1]，故而其能否修复AD的皮肤屏障值得探讨。以往研究表明：角质层含水量及经表皮水分丢失（TEWL）为反映皮肤屏障功能完整性的重要参数；神经酰胺（Cer）、丝聚蛋白（Filaggrin）含量增加可降低TEWL、提高角质层含水量。本研究旨在探索润肤止痒乳膏对AD患者及小鼠模型的皮肤屏障修复作用及机制[2]。

1 材料与方法

1.1 材料 50只健康BALB/c小鼠，SPF级，体质量（30±2）g（由温州医科大学动物实验中心提供）；润肤止痒乳膏、基础乳膏为温州市中西医结合医院制剂中心提供（润肤止痒乳膏主要药物成份为白及、丹皮、马齿苋、甘草）；丝塔芙乳膏（高德美加拿大公司生产，生产批号：20170221）；试剂：小鼠铜蓝蛋白（CER）（源叶生物），引物合成（Invitrogen公司），逆转录试剂盒（Thermo公司），核酸染料（赛百盛GoldView），Filaggrin（USCN 公司），β-Actin（北京中杉）；皮肤参数检测设备（意大利Callger soft 5.5六参数皮肤测试仪）。

1.2 临床试验

1.2.1 病例选择 符合AD诊断标准[3]，且皮损特征符合慢性皮炎特征：斑片色暗红，抓痕、鳞屑、干燥、粗糙、苔藓样变；1周内未外用糖皮质激素。

1.2.2 试验方法 将105例符合标准的患者采用随机数字表法分为3组，每组35例，3组患者分别外用润肤止痒乳膏（润肤止痒乳膏组）、基础乳膏（基础乳膏组）、丝塔芙乳膏（丝塔芙乳膏组），2次/d，共使用12周。

1.2.3 皮肤屏障功能测定 患者静坐30 min后开始测试并控制测试环境稳定（20℃≤室温≤25℃；45%≤湿度≤65%），测其皮损处角质层含水量及TEWL，处每项指标均检测3次，取均值。测试时间为：用药前、用药12周。

1.3 动物实验

1.3.1 模型鼠准备 于温州医科大学动物实验中心饲养小鼠，保持恒温恒湿的清洁环境。适应性饲养1周。观察其饮食、饮水正常，且无妊娠。1周后采用随机数字表法分为5组：空白组、模型组、润肤止痒乳膏组、基础乳膏组和丝塔芙乳膏组。实验前7 d用8%硫化钠溶液在小鼠背部选取2 cm×2 cm大小皮肤涂擦脱去体毛，将丙酮与橄榄油按3∶1混合，使用混合溶液将二硝基氟苯（DNFB）配置成0.5%浓度。实验开始第1天与第2天使用0.5% DNFB进行小鼠皮损致敏与激发，于脱背部毛区各涂擦 1 次/d，100 μL/次，第 3～6 天不涂药，第 7 天起每隔2 d用70 μL涂擦1次，第28天观察小鼠皮肤是否出现红斑、脱屑、苔藓样变等临床表现，若有表示造模完成。空白组脱毛处理后正常饲养，不作干预。

1.3.2 干预方法 5组小鼠除空白组、模型组不作干预外，其余3组分别在脱毛区使用润肤止痒乳膏、基础乳膏、丝塔芙乳膏，剂量均为100 μL/次，1次/d，连续使用2周。

1.3.3 指标检测方法 ①造模完成后随机选取模型组小鼠2只处死，取下背部脱毛处的皮肤（不含皮下脂肪）用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色后显微镜下观察组织病理改变。②干预结束后，将动物处死，取下背部皮肤并将组织绞碎，-80℃保存。用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测Cer含量，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和West Blot法检测Filaggrin基因的表达和蛋白的含量。

2 结果

2.1 临床试验 用药前，润肤止痒乳膏组与基础乳膏组、丝塔芙乳膏组比较，基础乳膏组与丝塔芙乳膏组比较，角质层含水量、TEWL差异均无统计学意义（P>0.05）；用药12周后，润肤止痒乳膏组与基础乳膏组、丝塔芙乳膏组比较，角质层含水量明显升高（t=4.16、2.95，均 P<0.01），TEWL 明显降低（t=3.22、2.86，均P<0.01）；基础乳膏组与丝塔芙乳膏组比较，角质层含水量升高不明显（t=0.97，P>0.05），TEWL 降低不明显（t=1.03，P>0.05）；润肤止痒乳膏组、基础乳膏组、丝塔芙乳膏组角质层含水量较用药前均增加（t=9.43、6.34、6.02，均 P<0.00），TEWL 明显降低（t=10.16、5.82、6.51，均 P<0.00）。见表 1。

2.2 动物实验

2.1 皮损表现 造模成功后，小鼠背部皮肤表现为红斑、苔藓样变、脱屑、结痂等AD皮损改变见图1，空白组皮肤表现见图2。

表1 3组治疗前后角质层含水量、TEWL变化情况 （±s）

表1 3组治疗前后角质层含水量、TEWL变化情况 （±s）

注：用药前3组两两比较，#P>0.05；与同组治疗前比较*P<0.00；与润肤止痒乳膏组比较，△P<0.01；与基础乳膏组比较，▲P>0.05。

T E W L（g/h·c m 2）润肤止痒乳膏组 3 5用药前 1 8.7 3±3.6 5# 3 2.4 1±5.3 5#用药1 2周 3 3.4 1±5.9 3* 1 7.3 5±3.6 1*基础乳膏组 3 5 用药前 1 8.6 0±3.5 2# 3 2.6 7±5.4 8#用药1 2周 2 5.1 2±4.3 6*△ 2 1.4 2±4.3 7*△丝塔芙乳膏组 3 5 用药前 1 8.9 2±3.7 4# 3 2.3 3±5.2 6#用药 1 2周 2 7.5 8±4.7 2*△▲ 2 1.8 5±4.4 5*△▲组别 n 角质层含水量（%）

图1 AD皮损改变

图2 空白组皮肤表现

2.2 皮肤组织病理变化 送检模型组：角质层可见角化过度或角化不全、有浆液性渗出；棘层可见细胞增厚、细胞内水肿及海绵水肿，基底层可见液化变性；真皮层血管周围见淋巴细胞浸润，有明显红细胞外溢出；符合AD皮肤组织病理学改变。

图3 模型组皮肤病理改变 （HE染色×400）

2.3 各组Cer含量、Filaggrin基因、Filaggrin蛋白表达情况 与空白组比较，模型组Cer、Filaggrin基因、Filaggrin蛋白含量均明显下降（均P<0.01）；基础乳膏、丝塔芙乳膏及润肤止痒乳膏均可增加模型鼠皮损处Cer、Filaggrin基因Filaggrin蛋白含量（均P<0.05）。各治疗组间比较：润肤止痒乳膏在升高模型鼠皮损处Cer、Filaggrin mRNA上与其他2组比较有优势（均P<0.05）；丝塔芙乳膏、基础乳膏在升高各指标上差异无统计学意义（均P>0.05）；各治疗组在升高Filaggrin蛋白含量上差异无统计学意义（均P>0.05）。见表 2、图 4。

表2 各组Cer含量、Filaggrin基因、Filaggrin蛋白表达情况 （±s）

表2 各组Cer含量、Filaggrin基因、Filaggrin蛋白表达情况 （±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较#P<0.05；与基础乳膏组、丝塔芙乳膏组比较△P<0.05；与基础乳膏组比较，▲P>0.05；与基础乳膏组比较☆P>0.05；与丝塔芙乳膏组比较★P>0.05。

F i l a g g r i n基因表达含量空白组 1 0 8 1.3 4±2 3.4 1 1.0 0±0.1 2模型组 8 1 5.8 1±1 0.5 4* 0.0 4±0.0 1*基础乳膏组 1 0 1 8.6 7±1 1.7 2# 0.1 0±0.0 1#丝塔芙乳膏组 1 0 2 1.3±9.1 0#▲ 0.1 3±0.0 3#▲润肤止痒乳膏组 1 0 3 6.7 6±1 8.6 7#△ 0.2 9±0.0 4#△组别 n C e r含量（μ g/m L）F i l a g g r i n蛋白表达含量1.5 5±0.0 1 0.7 4±0.0 5*1.0 9±0.0 5#1.2 7±0.0 2#▲☆1.3 3±0.0 1#☆★

图4 Filaggrin蛋白电泳图

3 讨论

AD的发病机制目前尚未完全明确，有学者认为该病与皮肤屏障功能损伤有关，TEWL是皮肤通透屏障中较为重要的指标，其表示经皮肤向外界扩散的水份。在AD患者中，TEWL会明显升高、角质层含水量则明显降低[2]。Cer为表皮脂质的重要组成部分，而表皮脂质起到储水保湿的功效，从而维持正常的皮肤屏障功能[4]。国外研究也表明表皮中Cer含量的高低与AD皮损的严重程度有关[5]。有学者通过临床观察证实：AD患者表皮中Cer含量明显降低，通过保湿剂干预后其Cer含量显著上升[6]。Filaggrin为构成角质层的重要蛋白，研究表明该蛋白缺失会破坏皮肤屏障，TEWL加快，从而引起皮肤干燥并增加过敏原的暴露机会[7]。有报道发现AD患者皮损区中角质层与颗粒层Filaggrin含量偏低[8]。也有研究显示，AD患儿无论皮损还是周围外观正常的皮肤，其Filaggrin蛋白表达均有下降[9]。AD患者中Filaggrin蛋白的低含量与缺氧诱导因子干预下基因的低表达密切相关[10]。

润肤止痒乳膏成分中，马齿苋有着清热解毒、凉血止血功效，且有动物实验表明其鲜榨汁外敷可以升高湿疹模型大鼠皮损中Filaggrin蛋白含量[11]；白及能收敛止血，消肿生肌，有临床观察显示外用含有白及成分的乳膏制剂可以显著降低角化性湿疹患者的瘙痒程度及皮损面积[12]。也有实验表明，含有白及的中药洗剂对皮炎湿疹类疾病疗效较好[13]。牡丹皮清热凉血，活血祛瘀，动物实验显示，含有丹皮酚成分的乳液可以修复AD小鼠模型受损的皮肤屏障[14]。甘草可以清热解毒，临床观察证实，复方甘草油外用对AD有效[15]。诸药共奏养血润肤止痒之功。

该研究表明，AD患者在经润肤止痒乳膏治疗后可以降低TEWL，增加角质层含水量，从而达到修复皮肤屏障的作用，基础乳膏与丝塔芙乳膏也有相似作用，但二者效果均不及润肤止痒乳膏。从动物实验中可以看出，润肤止痒乳膏可以增加模型鼠皮损中的Cer含量，促进Filaggrin基因的表达增加Filaggrin蛋白含量，通过如上机制来修复受损的皮肤屏障；而基础乳膏、丝塔芙乳膏作用与之相仿，但润肤止痒乳膏在增加Cer含量、促进Filaggrin基因的表达上优势明显。