调控JAKS/STATS通路探讨健脾祛湿法治疗寻常型银屑病的机制

刘朝霞，魏建华，姚尚萍，丰靓，刘红霞

（新疆维吾尔自治区中医医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐830000）

银屑病是一种由多基因遗传决定的、多环境因素刺激，免疫介导的，以角质形成细胞增生过度、分化不全、大量炎性细胞浸润和新生血管形成为主的慢性炎症性组织病理改变的皮肤类疾病[1-2]。Janus激酶-信号转导子与转录激活子信号通路（JAK/STAT）作为机体内普遍存在的经典信号通路，在免疫调节中发挥重要作用，主要通过多种细胞因子调控，介导参与机体内免疫细胞分化、调节免疫应答、介导炎性反应、刺激细胞凋亡和增殖等过程[3]。

健脾解毒汤是岐黄学者，全国名老中医药专家刘红霞教授结合新疆的地域特征治疗银屑病的经验方，经多年临床观察，疗效确切，刘红霞教授认为新疆年降水量少，气候干燥，燥邪伤津耗气，津伤则津液阴血不足，津液、阴血均为气所化生，亦为气之物质基础，脾为后天之本，为气血津液生化之源，故燥邪易伤及脾胃；新疆冬季漫长，饮食以肉食为主，易生湿化热，伤及脾胃，提出“健脾祛湿法”治疗银屑病的学术思想，自拟健脾解毒汤运用临床疗效满意。为进一步验证健脾解毒汤治疗寻常型银屑病的作用机制，本次实验，通过健脾解毒汤全方及不同拆方干预脾虚湿盛型寻常型银屑病小鼠，检测JAK/STAT信号通路中，转录因子（STAT）3，磷酸化转录因子（p-STAT）3，STAT5，p-STAT5 在脾虚湿盛型银屑病小鼠组织中的表达，评估健脾解毒汤及拆方对寻常型银屑病治疗的贡献大小，进一步阐释健脾祛湿法治疗银屑病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物美国癌症研究所（ICR）小鼠 70 只，4～6 周龄；体质量 18～25 g，平均 20.4 g；由新疆医科大学动物实验中心提供（动物批号：XJDC-1811）。TIANScript RT Kit购自中国天根公司；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）购自中国天根公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自中国Solarbio公司；Anti-STAT3抗体（ab68153）购自美国Abcam公司；Anti-p-STAT3抗体（9145）购自美国CST公司；Anti-STAT5抗体（ab32043）购自美国Abcam公司；Anti-p-STAT5抗体（ab32364）购自美国 Abcam公司；Pierce Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）购自美国Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 动物建模制备和分组给药

1.2.1.1 动物分组 动物均适应性喂养1周。随机分为7组，每组10只：空白对照组（A组）、阿维A胶囊组（B组）、健脾汤组（C组）、解毒汤组（D组）、健脾解毒汤组（E组）、脾虚模型组（F组）、脾虚+银屑病组（G组）。

1.2.1.2 脾虚湿盛动物模型 将生大黄以10倍体积的纯净水浸泡过夜，大火煮沸后转文火并保持15 min。倒出药汁，再以8倍体积水重复1次，合并滤液，浓缩至100%。置于4℃冰箱冷藏备用。

对B组、C组、D组、E组、F组、G组中的每只小鼠用大黄水煎液灌服，0.6 mL/只，共7 d。

1.2.1.3 脾虚湿盛型银屑病动物模型 将B组、C组、D组、E组、G组中的小鼠背部剃毛，面积为3 cm×5 cm，局部外用5%咪喹莫特乳膏50.0 mg/d，均匀涂抹于小鼠背部无毛区域，厚度约为1～2 mm，充分涂抹以使药物尽可能被皮肤吸收，单指轻压按摩约60次，1 次/d，连续用药 8 d。

1.2.1.4 健脾解毒汤及拆方给药 A组、F组和G组0.2 mL蒸馏水灌胃，1次/d；B组用药量为0.03 g/L，1次/d，定时灌胃1 mL，D组、C组和E组用药量为1.67 mL/（kg·d），连续用药28 d。

1.2.2 皮损组织病理学检查 相应皮损组织用固定液固定组织标本，常规石蜡包埋、切片，HE染色后在光镜下观察组织病理变化。

1.2.3 RT-qPCR 通过DNAMAN软件设计STAT3、STAT5、GAPDH荧光实时定量PCR引物，并由上海生工有限公司合成。分别加入2 μL 5×PrimeScript Buffer，0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μL Oligo（dT）15（15μM），0.5 μL Random 6 mers（100 μM），Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O达到10 μL，混匀后短暂离心，在PCR仪上37℃温浴 15 min，85 ℃加热 5 s，稀释至 35 μL，得到反转录的 cDNA。 qPCR 反应：Forward Primer 10 μM 0.8 μL，0.8 μL Reverse Primer 10 μM，2XSYBR Select Master Mix （2×）10 μL，RNase-free water 6.4 μL，cDNA template 2 μL，配制成20 μL体系混合均匀，在仪器上保持 95℃，1 min，95℃，10 s，60℃ 34 s，40个循环，94℃ 1 min 30 s，60℃ 1 min，60℃→94℃，1.1℃/s升温，从而获得qPCR反应结果。

1.2.4 免疫印迹法（Western blot） 将少量皮损组织块置于1～2 mL匀浆器中球状部位，加400 μL单去污剂裂解液（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆，重复碾几次使组织尽量碾碎，裂解30 min后，在4℃下12 000转/min离心5 min，取适当稀释的上清液用BCA法来测定蛋白浓度，调整蛋白质浓度后采用 Western blot检测组织内 STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5的表达，其步骤大致如下；经过灌胶、加样、电泳、转膜后，将膜装入5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，制置室温摇床1 h，加5 mL一抗稀释液于4℃冰箱过夜。然后加10 mL二抗稀释液（1∶10 000）置于摇床上 1 h，显色，在暗室中压片曝光显影，结果用Quantity-one图像软件分析并进行光密度值扫描，分别计算目的蛋白条带与GAPDH强度比值（%）。

2 结果

2.1 皮损组织病理变化 皮损组织苏木精-伊红染色实验结果，见图2A～G。在100×倍镜下观察，各组小鼠皮损组织形态：A组小鼠表皮层相对较薄，真皮层较为紧密。F组与其相比，炎性细胞浸润，表皮无明显增生现象，表皮较正常组变薄，脾虚湿盛型银屑病模型，表皮增生明显，伴有Munro微脓肿，内有炎性细胞及表皮细胞碎片，角化不全严重，形成银屑病样皮损。B组、C组、D组和E组有不同程度的缓解，其中E组优于其他各治疗组。

2.2 STAT3和STAT5 mRNA表达差异型 对A、B、C、D、E、F、G 各组的皮损组织进行 STAT3 和STAT5的实时荧光定量实验，进行其mRNA表达差异型分析，见表1、图2。STAT3和STAT5的mRNA表达结果显示，A组与其他各组之间差异有统计学意义（P<0.05）；F组、G组与其他各组之间差异有统计学意义（P<0.05）；E组与D组、C组之间差异有统计学意义（P<0.05）；E组与B组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

图1 小鼠皮损组织的病理图（苏木精-伊红染色×100）

表1 各组皮损组织中STAT3、STAT5的mRNA表达情况

图2 各组组织中STAT3、STAT5 mRNA的表达情况

2.3 STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5 在皮损组织中蛋白表达差异型 对A、B、C、D、E、F、G各组的皮损组织进行STAT3、STAT5、p-STAT3和p-STAT5的Western blot实验，进行蛋白表达差异型分析，见表2、图3A～D。STAT3和STAT5的蛋白表达结果显示，各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。p-STAT3和p-STAT5蛋白表达结果显示，A组与其他各组之间差异有统计学意义（P<0.05）；F组、G组与其他各组之间差异有统计学意义（P<0.05）；E组与D组、C组之间差异有统计学意义（P<0.05）；E组与B组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 各组皮损组织中STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5的蛋白表达情况

图3 各组组织中STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5蛋白的表达情况

3 讨论

银屑病是一种有遗传背景、与免疫反应异常有关的、临床常见的慢性炎症性皮肤病，全球发病率约为1%～3%[2，4]。目前研究表明，银屑病和多个基因遗传密切相关，皮损部位内异常T淋巴细胞浸润为银屑病发生的重要因素，T细胞的异常活化会主动或被动的分泌多种细胞因子，这些细胞因子可以通过 JAKs/STATs、MAPK、NF-κb 等多条信号通路，参与到银屑病发病过程中，但JAK/STAT信号通路是机体内非常重要的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，大多数细胞因子主要通过JAK/STAT信号通路发挥其生物学功能[5]。在银屑病发病过程中，JAK/STAT信号通路参与皮损表皮基层角质细胞的异常分化、血管异常增生、过度角化等多种病理过程，因此JAK/STAT信号通路在银屑病的免疫反应和炎性反应及细胞信号传递中发挥重要作用[6]。

JAK/STAT信号通路是继Ras信号通路后，近年来发现的一条新型的信号通路，其信号通路较为简单，但可在不同细胞因子的刺激下，将信号转导通路和细胞增殖、分化、侵袭、凋亡及免疫调控等多种重要的生物功能相联系[3，7]。而JAK/STAT信号通路的缺陷或异常活化都可与银屑病的发生发展及预后有着密不可分的关系。Jak是一类胞质内非受体型可溶型酪氨酸蛋白激酶，目前发现有4个成员：Jak1、Jak2、Jak3和Tyk2。STAT包含7个家族成员：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。本次实验重点关注STAT3和STAT5。STAT3和STAT5均属于JAK2的底物，结合活化后可使STAT3和STAT5磷酸化，并迅速形成同源或异源二聚体，转运至细胞核内，与相关的启动子结合，调节靶基因转录，实现细胞因子受体介导的信号传导，发挥信号调控作用，进而起到机体免疫调控作用和获得型免疫应答反应[8-9]。

银屑病属中医“白疕’、“松皮癣”、“干癣”等范畴。中医药在治疗银屑病上积累了丰富的临床经验，大量研究证明中医药有确切疗效，尤其在控制复发及药物安全型上优势明显。本次实验通过“健脾祛湿法”干预小鼠动物模型，结果发现脾虚湿盛型银屑病皮损组织的病理表征明显，在药物干预后，有明显治愈现象，健脾解毒汤相对其他方法效果更为优异。脾虚湿盛型银屑病中STAT3和STAT5在mRNA水平上，表达异常升高；健脾解毒汤及拆方干预后，可有效降低STAT3和STAT5的mRNA表达量，健脾解毒汤作用最为明显。在蛋白表达方面，p-STAT3和p-STAT5蛋白表达量在脾虚湿盛型银屑病中表达量异常升高，健脾解毒汤及拆方干预后，有效的降低了其表达量，其中健脾解毒汤作用也是最为明显。说明健脾解毒汤可抑制STAT3和STAT5在mRNA水平上的表达、抑制STAT3和STAT5的磷酸化，通过抑制STAT3和STAT5的表达和磷酸化，可使细胞因子传导中断或干扰，阻止银屑病角质形成细胞的过度增殖分化和炎性反应侵润，促进皮损的消退，发挥治疗银屑病的作用。