甘草酸对银屑病模型小鼠的作用研究

白美蓉 ，孙吉 ，付丽新 ，王文菊 ，陈涛

（1.成都市第二人民医院，四川 成都 610017；2.四川医疗器械生物材料和制品检验中心，四川 成都610000）

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，是多基因遗传背景的由T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，目前尚无根治方法。甘草酸是豆科植物甘草的主要药理活性成分，有抗炎、抗氧化、调节免疫及抗病毒等作用。目前在东亚地区，甘草酸制剂被作为一种安全有效的抗炎、免疫调节剂，广泛用于多种炎性及自身免疫性皮肤疾病，如寻常型银屑病、特应性皮炎、白癜风、斑秃、系统性红斑狼疮、过敏性紫癜等的治疗并受到广泛关注[1-5]。甘草酸药理作用靶点及分子机制尚不完全清楚。本研究以角蛋白14-血管内皮生长因子（K14-VEGF）转基因小鼠作为银屑病动物模型，探讨甘草酸对该银屑病模型小鼠的治疗作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 复方甘草酸注射液购于Nippon Kayaku公司；CD11c免疫组化抗体、过氧化物酶（MPO）免疫组化抗体购于博奥森公司；CD3抗体购于Abcam公司；SYBR荧光染料、逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒购于Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与药物处理 K14-VEGF转基因小鼠由四川大学生物治疗国家重点实验室赠送。将20只发病程度中至重度的12周龄K14-VEGF转基因小鼠随机分为2组，每组10只，即模型对照组和甘草酸治疗组。治疗组小鼠腹腔注射复方甘草酸注射液（20 mg/kg），1 次/d，连续 7 d；对照组小鼠腹腔注射等体积磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。

1.2.2 皮损严重程度评分 基于银屑病皮损面积及严重度指数（PASI）评分的改良评分标准：根据4项（皮损面积、红斑、鳞屑大小及数量）对治疗前后的所有小鼠耳部皮损进行综合评分（0=无，1=轻度，2=中度，3=重度），最终评分为4项总和（0～12分）。

1.2.3 组织学染色 甘草酸治疗7 d后，各组小鼠颈椎脱臼处死，并取各组小鼠耳部组织固定于4%多聚甲醛溶液中，制备石蜡切片。首先进行HE染色，观察各组小鼠耳部组织病理学表现，测量表皮厚度并进行Baker评分。然后进行免疫组化染色（MPO、CD11c和CD3），并用光学显微镜200倍下观察各组组织中中性粒细胞、树突状细胞和淋巴细胞浸润情况。

1.2.4 RT-PCR 甘草酸治疗7 d后，取各组小鼠耳部组织冻于液氮中，并取0.1 g耳部组织研磨成粉末后，提取组织RNA。反转录为cDNA后进行RTPCR反应。在25 μL RT-PCR反应体系中分别加入 12.5 μL SYBR Green qPCR Master Mix，9 μL 灭菌的ddH2O，1 μL cDNA和2.5 μL对应的引物。引物白细胞介素（IL）-6（Catalog：MQP036632）、IL-17（Catalog：MQP029457）、肿瘤坏死因子（TNF）-α（Catalog：MQP031019）和干扰素（IFN）-γ（Catalog：MQP027401）均是由 GeneCopoeia公司设计，经qPCR实验验证并优化的引物。以GAPDH作为内参基因。本实验反应条件为：预变性95℃3 min，变性95 ℃ 15 s，退火 58℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，共 40 个循环。

1.3 统计学方法 用SPSS16.0统计软件分析，2组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甘草酸可显著改善K14-VEGF转基因小鼠的银屑病样皮损表现 甘草酸治疗7 d后，肉眼观察发现治疗组小鼠皮损面积、红斑、鳞屑大小及数量等银屑病样皮肤损伤均显著减轻；而对照组小鼠银屑病样皮损持续加重，见图1A。同时通过改良后的PASI评分发现，甘草酸治疗后的小鼠皮损评分（6.33±1.29）显著低于对照组（11.33±1.37，P＜0.05），见图1B。

图1 甘草酸可有效治疗K14-VEGF转基因小鼠的银屑病样皮损改变。（**P<0.01）

2.2 甘草酸可显著减轻K14-VEGF转基因小鼠皮损的银屑病样病理组织学改变 光学显微镜下观察各组小鼠耳部皮损组织处组织学变化情况，如图2A所示，对照组小鼠可见显著的表皮组织增厚，棘突增长，大量炎性细胞浸润和显著的血管增生；而治疗组表皮增殖、血管扩张及炎性细胞浸润等银屑病样病理改变均得到显著抑制。与对照组小鼠表皮厚度（67.08±8.168）μm相比，治疗组小鼠表皮厚度（37.38±7.303）μm显著减小，见图2B；同时治疗组小鼠Baker评分（3.400±0.788）也显著低于对照组（6.950±0.797），见图 2C。

图2 2组小鼠耳部组织学改变情况。

2.3 甘草酸可显著减少K14-VEGF转基因小鼠皮损中炎性细胞的浸润情况 如图3所示，光学显微镜下观察2组小鼠免疫组化结果发现，与对照组相比，治疗组小鼠皮损处T淋巴细胞、中性粒细胞和树突状细胞的阳性细胞数均显著降低，见图3。

图3 CD3、MPO 和 CD11c免疫组化染色（×200）。

2.4 甘草酸可显著降低K14-VEGF转基因小鼠皮损中相关炎性细胞因子的表达情况 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测发现，与对照组相比，治疗组小鼠皮损处相关炎性细胞因子IL-17、IL-6和IFN-γ的表达均显著降低（P<0.05），见图4。

图4 各组小鼠耳部皮损处IL-17，IFN-γ和IL-6 mRNA表达情况。（**P<0.01）

3 讨论

甘草酸作为豆科植物甘草的主要药理活性成分，有抗炎、抗氧化、调节免疫及抗病毒等作用。近来，在结肠炎[6]、肠缺血再灌注损伤[7]、急性肺损伤[8]及过敏性鼻炎[9]等动物模型的研究中均显示甘草酸具有良好的抗炎作用。而且，体外研究表明，甘草酸能抑制TNF-α诱导的脐静脉内皮细胞（HUVECs）的细胞间黏附分子（ICAM-1）表达，抑制核因子（NF）-κB及丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）中 c-Jun氨基末端激酶（JNK）的活化[10]。随着对其药理作用的认识，一系列含甘草酸或甘草次酸的制剂（如：复方甘草酸苷等）在诸多炎症性皮肤疾病（如：银屑病、特应性皮炎等）中的应用受到了越来越多的关注[11-12]。然而其具体药理作用机制，目前仍不清楚。其临床使用亦不为欧美等国主流皮肤科医生理解与接受。本研究首先研究甘草酸对K14-VEGF银屑病模型小鼠的治疗效果。笔者发现甘草酸能明显抑制K14-VEGF小鼠银屑病样皮损及组织学表现，抑制表皮增殖及炎性细胞浸润。

目前，大量研究发现Th1/Th17细胞在银屑病的发病机制中扮演了重要的作用[13-15]。在银屑病的发病机制中，淋巴细胞、树突状细胞、中性粒细胞等为主要的浸润细胞。炎性细胞可在皮损处大量聚集。在本研究中也发现K14-VEGF银屑病模型小鼠皮损处有大量的炎性细胞（T淋巴细胞、中性粒细胞和树突状细胞）浸润，而甘草酸可显著抑制上述炎性细胞的浸润情况。研究发现炎性细胞在银屑病样皮损处可分泌多种炎性细胞因子，如IFN-γ，IL-6，IL-1 β，IL-8，IL-17，TNF- α 等，从而进一步诱导疾病的发展[16]。在本研究中发现甘草酸也可以抑制银屑病样皮损处相关炎性细胞因子IL-17、IL-6和IFN-γ的表达，从而有效改善银屑病样皮损改变，起到治疗银屑病的作用。

综上所述，本研究发现甘草酸可有效治疗K14-VEGF银屑病模型小鼠的银屑病样改变，其治疗作用是通过抑制炎性细胞浸润和相关炎性细胞因子IL-17、IL-6和IFN-γ的表达而实现的。该研究为临床使用甘草酸治疗银屑病等相关炎症性疾病提供了实验依据。