即食海蜇菌群分析与腐败菌种分离和鉴定

林以琳， 林 瑜， 缪 松， 曾绍校， 林少玲*

（1. 福建农林大学 食品科学学院，福建 福州350002；2. 爱尔兰农业部农业与食品发展局TEAGASC 食品研究中心，都柏林 科克R93XE12）

即食海蜇是一种水分含量高、低脂肪且营养丰富，具有抗氧化、免疫调节功能的食品[1]。 海蜇含有人体需要的多种营养成分，尤其含有人们饮食中所缺的碘，是一种重要的营养食品。 海蜇最主要的成分是胶原蛋白， 现代医学研究发现其具有抗氧化、抗疲劳和免疫调节功能，对治疗风湿性关节炎具有一定的效果[2-3]。 海蜇多肽可应用于抗氧化、降血脂、降血压等药物的开发[4-5]。 此外，据文献记载，海蜇对慢性气管炎、风湿、高血压等多种病症具有良好的疗效，已成为一种具有较高食用、营养及药用价值的名贵海洋食品。

新鲜海蜇含水量高，易分解和自溶，因此在加工过程中需要添加大量的食盐和明矾使其迅速脱水，收敛和凝固蛋白质[6]。 加入明矾可显著提高海蜇的贮藏品质，但同时也带来海蜇铝残留量过高的问题。 而人体中铝含量过高，则会对神经、骨骼及免疫具有潜在的毒性[7]。 即食海蜇制品通常是三矾盐渍海蜇经过清洗、切割、灭菌、包装等一系列加工处理后得到的即食食品。 即食海蜇生产加工中脱铝技术的应用，不仅降低了铝离子对人体的危害[8]还有效避免了微生物的生长。 根据我国农业部发布的NYT 1515-2007《绿色食品海蜇及制品》[9]，除了不得检出沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌外，大肠菌群和菌落总数也不得超标。 随着即食海蜇产品明矾含量及铝残留量的降低，湛江市场对软包装即食海蜇丝制品细菌学品质进行了分析，并对产品中残存细菌的安全性进行了评价[10]。 结果表明：即食海蜇产品大肠菌群数均为30 MPN/hg，革兰氏阴性杆菌（88.9%）、少量的革兰氏阳性无芽孢球菌（8.3%）、极少量的革兰氏阳性有芽孢杆菌（2.8%）。 对即食海蜇的微生物指标问题进行长期监控及有效控制， 是当前要解决的问题之一。 明确即食海蜇腐败变质的微生物种类，并针对性寻找有效的抑菌方法，有效提高即食海蜇的食用安全性及经济价值。

作者通过对即食海蜇产品进行菌群分析，并对腐败优势菌种进行分离、 纯化和16S rDNA 的PCR扩增与序列测定后经过BLAST 分析，明确腐败优势菌种类。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

即食海蜇：由福州永辉超市购得不同厂家生产的5 类即食海蜇产品；平板计数琼脂（PCA）培养基、营养肉汤培养基、 细菌基因组DNA 提取试剂盒：Solarbio 公 司 产 品；DreamTaq-TM DNA 聚 合 酶（EP0702）：MBI 公司产品；SanPrep 柱式质粒DNA小量抽提试剂盒：上海生工生物工程股份有限公司产品；pMD®18-T Vector 连接试剂盒：Takara 公司产品。

PL202-S100 型精密分析天平：Mettler Toledo（上海） 仪器有限公司产品；HPX-9000 型数显电热培养箱： 上海博迅实业有限公司医疗设备厂制造；2720 thermal cycler 型PCR 仪：Applied Biosystems公司产品；T6 新世纪紫外可见分光光度计： 北京普析通用仪器有限责任公司产品；MR6 数显恒温水浴锅：金坛市双捷实验仪器厂制造；101-0 型电热鼓风干燥箱：上海阳光实验仪器有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 即食海蜇样品中微生物污染状况各取10 g即食海蜇样品，放入含有90 mL 无菌稀释液的无菌均质袋内，于8000 r/min 均质2 min，制成1∶10（体积比）样品匀液。 取1 mL 样品匀浆，以1∶10（体积比）进行梯度稀释，全过程控制在15 min 内。以稀释后的即食海蜇样品为原料， 进行各种微生物的测定，测定方法如表1。

1.2.2 腐败优势菌种分离纯化各取1 mL 制得的稀释样品加入无菌锥形瓶中置于30 ℃摇床培养。取1 mL 培养后的菌液，以1∶10（体积比）进行梯度稀释，得到10-2、10-3、10-4稀释样品。 移取稀释样品各100 μL，涂布于PCA 培养基中，倒置于30 ℃恒温生化培养箱中培养72 h。 取出平板，挑取菌落，转接到新的固体培养基，采用三线划线法接种培养至分离到纯种菌落，重复纯化步骤5次。 挑取纯种菌落， 溶于营养肉汤培养基中进行富集培养，30 ℃培养24 h， 取1 mL 培养后菌液与体积分数50%灭菌后甘油1∶1（体积比）混合均匀，于-80 ℃超低温冰箱保藏。

表1 几种即食海蜇中常见微生物的测定方法Table 1 Methods for the determination of common microorganisms in ready-to-eat jellyfish

1.2.3 腐败优势菌种16S rDNA 序列鉴定根据细菌基因组DNA 提取试剂盒抽提腐败优势菌的DNA，并于-20 ℃冰箱冻存。

1.2.416S rDNA 的PCR 扩增与序列测定取抽提得到的腐败优势菌DNA 进行16S rDNA 的PCR 扩增， 其中正向引物为7F：5'-CAGAGTTTGATCCTG G-CT-3'， 反向引物为1540R：5'-AGGAGGTGATC CAGCCGCA-3'。PCR 循环设置：98 ℃预变性3 min；30个循环：98 ℃变性25 s，55 ℃复性25 s，72 ℃延伸1 min； 最后72 ℃温浴10 min，4 ℃30 min 终止反应。 通过琼脂糖凝胶电泳提取DNA 片段，送至上海生工技术公司进行测序。

1.2.5 序列分析与系统发育树的构建利用BLAST 对所得腐败优势菌的16S rDNA 序列进行相似性对比分析， 并使用Bootstrap 及Neighbour Joining 计算进化距离，构建系统发育树并分析。

2 结果与分析

2.1 即食海蜇样品中微生物污染状况

表2 即食海蜇细菌学品质指标Table 2 Bacterial standards of ready-to-eat jellyfish

如表2 所示， 即食海蜇样品中菌落总数为48000 CFU/g， 远高于国家标准所规定的不得高于30000 CFU/g，说明该产品被微生物污染。 同时，样品中并未检出大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，说明该产品在加工处理中受致病菌污染的可能性小，但总体上不符合即食海蜇产品的微生物限量标准规定。

2.2 16S rDNA 序列分析鉴定

2.2.116S rDNA 的PCR 扩增与序列测定提取经分离纯化后的2 菌株基因组DNA， 以其16S rDNA为模板进行PCR 扩增（图1）。 结果表明2 条目标条带约为1.35 kb。将菌株的阳性质粒送至上海生工生物公司测序，测得16S rDNA 大部分序列分别为1348 bp 和1336 bp（图2）。

图1 PCR 扩增16S rDNA 基因Fig. 1 PCR amplification of 16S rDNA gene

2.2.2 BLAST 同源性搜索与系统发育树的绘制菌株1 和菌株2 的16S rDNA 的序列分别经过BLAST 分析后，Burkholderia属的细菌与菌株1 与菌 株2 的16S rDNA 相 似 度 高 （表3）， 其 中Burkholderia lata和Burkholderia cenocepacia分 别与菌1、菌2 序列相似度达到99%和100%，因此菌株1 种属初步鉴定为Burkholderia lata、 菌株2 为Burkholderia cenocepacia。

图2 菌株的16S rDNA 碱基序列Fig. 2 Sequence of 16S rDNA of the strain

表3 菌株16S rDNA 序列同GeneBank 中细菌菌株同源性比较Table 3 Comparison of 16S rDNA sequence with the bacterial strain homology in GeneBank

将腐败优势菌的16S rRNA 基因序列与从Genebank 中选择的10 株菌进行系统进化分析，得到如图3 所示的系统发育树。 如图所示，菌株1 与Burkholderia latastrain FL-1-2-30-S1-D0、 菌株2与Burkholderia cenocepaciastrain 的分支的序列一致性达到95%，表明它们亲缘关系最近，进一步验证了鉴定结果。

3 结 语

即食海蜇食用方便，但保藏时间短。 在贮藏过程中容易受到环境中温度、pH 以及产品包装等方面的影响[16，19]，这些栅栏因子有助于即食海蜇中微生物的生长[20]。 已有报道，通过PCR 技术快速检测出海蜇中的腐败菌有芽孢杆菌、假单胞菌以及腐败希瓦氏菌[17-18]。 本文作者通过即食海蜇样品的菌群分析，并未检出大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌；但通过菌落总数分析法得知即食海蜇出厂3个月，其菌落总数（48000 CFU/g）已超出海蜇相关标准所规定（30000 CFU/g），但样品中说明该产品仍然被微生物污染， 菌落总数超标。菌落总数的快速增长严重影响即食海蜇的食用安全。 因此，明确腐败优势菌种是十分紧急且必要的。通过对腐败优势菌种进行16S rDNA 的PCR 扩增与序列测定后经过BLAST 分析，发现腐败优势菌群为革兰氏阴性菌并主要为Burkholderia菌属。Burkholderia菌属隶属于假单胞菌属，是富有运动性及好氧性，呈现棒状的革兰氏阴性菌。Burkholderia在可作为生物降解、生物控制及促进植物生长的主要微生物， 对人类免疫可造成潜在危害。 并且Burkholderia具有对抗生素的抗药性及高运动性，对于人类有较大的威胁。 所以，选择合适灭菌技术，有效抑制Burkholderia的生长， 从而对即食海蜇进行减菌处理具有十分重要的科学意义。

图3 菌株1 与菌株2 和相关菌株16S rDNA 基因序列系统进化树图Fig. 3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of strains 1，2 and related strains