新加归肾丸通过调节mTOR信号通路促进体外培养大鼠卵巢颗粒细胞增殖*

蔡 竞，李 楠，朱虹丽△，张 辉，李海英

1.陕西中医药大学附属医院(咸阳 712021)；2.陕西中医药大学(咸阳 712046)

卵泡发育障碍是指卵泡发育、成熟或排出障碍，临床上主要见于无排卵性不孕、黄体功能不足、闭经、排卵障碍性异常子宫出血等疾病。无排卵性不孕占女方因素不孕的25%～30%[1]，严重影响了妇女的生殖健康。肾虚血瘀是此类疾病的主要病机，前期动物实验研究表明：补肾活血中药复方新加归肾丸通过调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路促进雷公藤多苷致卵泡发育障碍大鼠模型卵巢颗粒增殖而促使卵泡发育[2-3]。颗粒细胞是卵巢中一类十分重要的细胞，被称为卵巢中的“体细胞”，颗粒细胞产生多种物质可作为支持卵母细胞生长成熟的营养物质[4]。mTOR参与了体内多条信号通路，其中PI3K/AKT信号通路是非常重要的一条，其促细胞增殖作用主要是通过mTOR实现的。鉴于颗粒细胞对于卵泡发育的重要性以及mTOR信号通路与细胞增殖的密切关系，在前期研究基础之上，本研究以mTOR信号通路为切入点，观察补肾活血中药复方新加归肾丸对离体大鼠颗粒细胞增殖的影响，通过现代医学研究阐释传统医学治疗疾病的靶点，为临床治疗用药提供科学依据。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验药物：新加归肾丸的组成为菟丝子、淫羊藿、枸杞子、山茱萸、干地黄、当归、茺蔚子各10 g，肉苁蓉20 g，生药总剂量90 g(药物购自陕西中医药大学附属医院中草药房)，由陕西中医药大学制剂研究室制成中药水提醇沉液。制备方法如下：上述药物于去离子水浸泡15 min； 合并两次煎煮液(每次煎煮15 min)； 冷却、去沉淀；加入95%乙醇，配置成乙醇浓度为50%混合液；静置过夜后离心、去沉淀；旋转蒸发仪回收乙醇；加去离子水溶至250 ml；离心后取上清；用0.1 mol/L，NaOH调10 ml水提纯液pH值至6.8～7.4，过滤除菌，4 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂和仪器：孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)(批号170823310)；胎牛血清(Fetal calf serum，FBS)(批号：SV30087.01)；二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(批号：C009)；细胞周期检测试剂盒(批号：KAG511)；雷帕霉素(批号：R8140)；兔抗磷酸化-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)多克隆抗体(批号：ab 63552)；兔抗细胞周期蛋白D2(Cyclin D2)多克隆抗体(批号：ab 7225)。超净工作台(型号：SW-CJ-2FD)；医用离心机(型号：L530)；光学倒置显微镜(型号：XSZ-D2)；二氧化碳培养箱(型号：FEARCELL 240i)。

1.3 实验动物：23～25 日龄未成年SD雌性大鼠 10 只，体重(50±10)g，由西安交通大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(陕)2009-0001。于室温为22～25 ℃、湿度为45%～65%的条件下分笼喂养，昼夜交替光照，自由饮水摄食，适应性喂养5 d。

2 实验方法

2.1 大鼠颗粒细胞的制备：参照文献[5]方法制备并培养大鼠卵巢颗粒细胞：取23～25日龄SD雌性大鼠10只，每只颈部皮下注射PMSG 50 IU以促进卵泡发育，用药后48 h，以颈椎脱臼法处死大鼠，并将处死后大鼠迅速置入75%酒精中浸泡3 min。在无菌状态下开腹，取出双侧卵巢、输卵管及周围脂肪组织，在超净工作台上用D-hank’s冲洗液反复冲洗组织，剪去输卵管及多余脂肪。将卵巢放入无血清培养基中，注射器针头刺破卵泡，轻轻挤压出卵泡内容物并收集，离心后加入培养液清洗2次，收集下沉之颗粒细胞，400目钢筛过滤，离心，计数。台盼蓝染色细胞，显微镜下计数蓝染死亡细胞，并计算细胞活率，细胞存活率>90%。将颗粒细胞以1×106个/ml接种于培养板中，37 ℃、5%的CO2培养箱内培养，48 h后换液1次，去除未贴壁的细胞。

2.2 颗粒细胞分组及药物处理：将细胞稀释成1×106个/ml浓度，按1×105个/孔的密度接种于96孔板中，培养48 h后分为空白组，模型组，中药低、中、高剂量组共五组，每组5个复孔。分别做以下处理：空白组加入含1%的FBS培养液；模型组加入含1%的FBS培养液及1.67 mg/ml的雷帕霉素；中药低、中、高剂量组加入含1%的FBS培养液，加1.67 mg/ml的雷帕霉素处理20 min后，吸掉上清，并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗一遍，然后再分别加入MEM/F12培养基稀释的不同浓度新加归肾丸水提醇沉液(低剂量组：2×10-5g/L；中剂量组为2×10-4g/L；高剂量组为2×10-3g/L)。分别继续培养24、48、72 h后检测。

2.3 观察指标及测定：流式细胞仪检测颗粒细胞周期各时相的变化，并计算细胞增殖指数。分别在培养24、48、72 h后采用流式细胞仪检测各组颗粒细胞周期各时相的变化。具体方法如下：①PBS清洗细胞2次，加入0.25 % 胰蛋白酶加0.02% 乙二胺四酸二钠溶液消化细胞；②细胞之间的连接断开、细胞变圆时立即加入10 %的DMEM/F12培养基，终止消化；③PBS 洗涤、离心、收集细胞沉淀、PBS洗涤、加入75%乙醇，于4 ℃固定4 h以上；④离心、PBS、加入溴化乙锭复合染液，4 ℃避光孵育30 min；⑤上流式细胞仪检测，读取G0/G1期、S期、G2/M期的结果，并计算细胞增殖指数(Cell proliferation index，PI)。PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。免疫印迹法检测颗粒细胞p-mTOR蛋白表达水平:提取细胞总蛋白；Bradford 法测定各组总蛋白浓度。 SDS-PAGE电泳；转膜；免疫杂交；化学发光显示目的条带，凝胶成像系统软件进行半定量分析，目的蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参灰度值。

结 果

1 各组大鼠卵巢颗粒细胞24、48、72 h细胞周期变化 用药24、48、72 h这3个时段，模型组S期细胞比率、PI指数均低于空白组，相比较差异有统计学意义(P<0.05)。中药各个剂量组S期细胞比率、PI指数均高于模型组，相比较差异均有统计学意义(P<0.05)。中药各个剂量组比较，除24 h时段S期细胞比率外，中药中剂量组S期细胞比率、PI指数均高于其他两组，相比较差异有统计学意义(P<0.05)。在用药48 h，中药各组G1期向S期转化均活跃，用药72 h的G1期向S期转化逐渐缓慢。见表1～3。

表1 各组颗粒细胞24 h细胞周期比率分布及PI指数

表2 各组颗粒细胞48 h细胞周期比率分布及PI指数

表3 各组颗粒细胞72 h细胞周期比率分布及PI指数

2 各组颗粒细胞24、48、72 h的Cyclin D2蛋白表达 用药后24、48、72 h这3个时段，模型组Cyclin D2蛋白表达水平均低于空白组，相比较差异有统计学意义(P<0.05)。中药各个剂量组Cyclin D2蛋白表达水平均高于模型组，相比较差异有统计学意义(P<0.05)；中药各剂量组间比较，中药中剂量组Cyclin D2蛋白表达水平均高于其他两组，差异有统计学意义(P<0.05)，中药高剂量组与低剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4(图1～3)。

3 各组颗粒细胞24、48、72 h的p-mTOR蛋白表达 用药后24、48、72 h这3个时段，模型组p-mTOR蛋白表达水平均低于空白组，相比较差异具有统计学意义(P<0.05)；中药各个剂量组p-mTOR蛋白表达水平均高于模型组，相比较差异具有统计学意义(P<0.05)；中药各个剂量组间比较，中药中剂量组p-mTOR蛋白表达水平均高于其他两组，相比较差异有统计学意义(P<0.05)，中药高剂量组与中药低剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5(图1～3)。

表4 各组颗粒细胞24、48、72 h的Cyclin D2蛋白相对表达量

表5 各组颗粒细胞24、48、72 h的p-mTOR蛋白相对表达量

图1 各组颗粒细胞24 h的Cyclin D2、p-mTOR蛋白表达

图2 各组颗粒细胞48 h的Cyclin D2、p-mTOR蛋白表达

图3 各组颗粒细胞72 h的Cyclin D2、p-mTOR蛋白表达

讨 论

颗粒细胞是卵泡最主要的功能单位，通过丝状伪足和缝隙连接为卵母细胞提供了与外界交流的结构通道，以利于卵泡的生长发育[6]。有报道指出，与同颗粒细胞共同培养的未成熟卵母细胞(由给幼年雌性大鼠注射孕马血清促性腺素促排卵后获得)比较，单独培养的卵母细胞成熟率明显降低；且前者IVF成功率和活胎出生率接近于IUI[7]。说明颗粒细胞对于促进卵母细胞的成熟是必需的。细胞周期可划分为G0/G1期、S期、G2期和M期4个连续时期，在S期DNA开始合成，而细胞DNA水平可反映细胞增殖力[8]。细胞周期的顺利进行是细胞增殖的重要条件[9]。如果能够促进细胞G1期向S期转变，就能够促进细胞增殖，反之则会导致细胞阻滞于G1期，进而发生凋亡。Cyclin D2是细胞周期G1/S的正性调节因子[10]。在卵巢组织中，Cyclin D2主要表达于卵泡颗粒细胞上，垂体切除的雌性小鼠卵巢颗粒细胞内Cyclin D2表达水平非常低，从而抑制颗粒细胞增殖及卵泡生长[11]。FSH介导的颗粒细胞增殖实验表明：磷酸化P70S6K水平和Cyclin D2mRNA水平均明显升高，而在应用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素处理后，两者水平均明显降低[12]，说明Cyclin D2作为mTOR信号通路的下游分子在卵巢颗粒细胞增殖中发挥着重要的作用。

肾为先天之本、元气之根，主生殖，肾藏精，精化气，精生血，血养精，卵子又属肾中生殖之精，卵泡的正常发育有赖于肾精的充盛，卵子的顺利排出有赖于肾气的鼓动，补肾填精是治疗卵泡发育障碍性疾病的基本方法。肾精亏损可通过多个环节导致瘀血形成[13]。反过来，瘀血又会影响肾的生理功能，造成虚实夹杂的病理机制。因此在治疗此类疾病时，常在补肾填精的基础之上添加养血活血之品，使得精血源足，血脉流畅，卵子得以正常发育排出而受孕。林湫莹[14]通过研究46篇有关中药治疗卵巢储备功能下降相关文献，发现该病中医证型分布以肾精亏虚证最为常见，肾虚血瘀证位居第二，印证了此类疾病本虚标实的病机根本。新加归肾丸基于“肾藏精，主生殖”“精血足则卵泡长而有源，气血畅则卵泡动而有力”中医生殖理论，以“补肾活血”为法，由景岳名方归肾丸加减化裁而成，具体方药如下，肉苁蓉、菟丝子、淫羊藿、枸杞子、山茱萸、干地黄、当归、茺蔚子。方中肉苁蓉甘温专补肾中水火，菟丝子平润补阳益阴，填髓充精，共奏补肾阳，益精血之功，共为主药。淫羊藿助肉苁蓉补肾壮阳；干地黄养阴血，填骨髓，性甘寒，又制淫羊藿之温燥；山萸肉酸涩，平补肝肾，助阳益精，补中寓涩，共为辅药。枸杞子滋阴补血益精，与菟丝子皆为种仁；当归补血活血，补而不滞；茺蔚子活血通经，理气开郁，泻而通之，泻有形之瘀，共为佐使药。全方阴阳并举，通补兼施，共助补肾活血。

有学者发现在小鼠初级卵泡颗粒细胞体外培养过程中添加mTOR抑制剂雷帕霉素后，停滞在有丝分裂G1期的颗粒细胞比例也呈剂量依赖性增加，可见雷帕霉素可通过抑制mTOR信号通路阻滞卵巢颗粒细胞增殖[15-16]。因此本实验选择雷帕霉素预处理的颗粒细胞为实验对象。本实验研究结果表明：在各个时间段，模型组p-mTOR、Cyclin D2表达均低于空白组，S期细胞比率和PI指数均低于空白组，说明雷帕霉素可抑制离体大鼠卵巢颗粒细胞的增殖；应用新加归肾丸水提醇沉液后各个浓度组p-mTOR、Cyclin D2表达、S期细胞比率、PI指数均高于模型组，说明补肾活血中药复方新加归肾丸可促进被雷帕霉素抑制的颗粒细胞的增殖，这种促进作用可能是通过激活mTOR信号通路，上调Cyclin D2蛋白表达，促使颗粒细胞由G1期向S期转化，推动细胞周期进程实现。这与前期实验研究结果[2]相吻合。因此我们推测：补肾活血中药复方新加归肾丸可能通过激活mTOR信号通路活性，加速卵巢颗粒细胞周期进程，促进颗粒细胞增殖来实现改善卵泡发育，为临床治疗卵泡发育障碍性疾病提供诊疗思路。