活血化痰胶囊对血管性痴呆大鼠海马区B淋巴细胞瘤-2表达的影响*

林 聪，黄晓松，易艳辉，李 萍，杨 莹，李远红，刘柳青

湖南省脑科医院神经内科(长沙 410008)

血管性痴呆(Vascular dementia,VD)属于一种慢性疾病，主要是一系列脑血管疾病因素所致的脑组织、脑循环出现障碍的一种智能损害综合症[1]，临床表现主要为认知功能障碍，严重威胁着患者的身心健康[2-3]。氧化应激(Oxidative stress,OS)主要是因为机体出现氧化与抗氧化失衡现象，导致损伤了组织、细胞的氧化，其在血管性痴呆发生与发展的各环节中都发挥重要作用[4-5]。B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因是一个原癌基因，可抑制神经元凋亡和坏死，也可促进神经元的存活以及突触的再生[6-7]。Bcl-2表达增加可能对脑缺血后的神经细胞起到保护作用[8]。血管性痴呆属于祖国医学的“呆病”范畴，基本病机为痰蒙心神、髓海不足、血瘀痹阻及虚火上扰，属于本虚标实的一种疾病[9-10]。中医治疗该病，在延缓病情进展、改善患者全身症状等都有一定的疗效，主要治法为除湿化痰、理气活血、补肾填髓、活血化痰等[11]。本文具体探讨了活血化痰胶囊对血管性痴呆大鼠海马区Bcl-2表达的影响，希望为中医临床制定合理的治则、治法奠定基础。

材料与方法

1 实验材料 SPF级成年雄性Sprague Dawley大鼠60只购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物许可证编号00010751)。4～5周龄，体重140～160 g。饲养环境：温度在22 ℃～24 ℃，相对湿度40%～60%，饮食、饮水自由，12/12 h光照黑暗循环。安理申(盐酸多奈哌齐片，国药准字H20070181，规格5 mg/片)。活血化痰胶囊(国药准字Z20100045)为当前临床上治疗老年性痴呆的经验方，由熟地、山萸肉、川断、田七、枸杞、淫羊藿、首乌、锁阳等组成，胶囊3 g/粒。MT-200 Morris水迷宫购自成都泰盟科技有限公司，抗Bax抗体、抗Bcl-2抗体都购自北京中杉金桥生物有限公司。

2 实验方法

2.1 血管性痴呆大鼠模型的建立：采用双侧颈动脉缺血再灌注法制作血管性痴呆模型，碘伏消毒大鼠颈部并固定，从大鼠颈正中纵行1.5 cm 的切口，切开皮肤后，逐层钝性分离皮下组织及肌肉等，暴露大鼠双侧颈总动脉。双结扎手术线的两侧颈总动脉近心端、远心端部位，缝合皮肤，常规抗生素预防感染。建模成功标准：大鼠无明显的肢体运动障碍，但是出现轻微的反应迟钝，精神萎靡。

2.2 实验动物分组与处理：将建模成功的54只大鼠(6只大鼠造模不成功的原因包括死亡、严重感染等)随机分三组即模型组、西药组与中药组，各18只。西药组与中药组分别给予多奈哌齐3 g灌胃与活血化痰胶囊3 g灌胃(灌胃量为1 ml/100 g体重)，模型组以等剂量的生理盐水代替。三组给药时间都为21 d。大鼠灌胃时，右手持灌胃注射器，左手拇指和食中二指相对，抓住大鼠颈部皮肤，使大鼠的头部和颈部及躯干呈一直线。大鼠的灌胃针长8 cm，直径1.2 mm。

2.3 观察指标：①在给药后7、14、21 d进行Morris水迷宫实验，通过计算机对大鼠从入水开始，直到跳上平台这一段时间进行记录，从而确定逃避潜伏期时间，若2 min内大鼠未找到平台则记录为大鼠的逃避潜伏期为2 min。②在给药后21 d处死所有大鼠，完整取出鼠脑，置于中性甲醛溶液中固定48 h并石蜡包埋，采用HE染色记录脑组织病理变化情况。同时将其与大脑组织在玻璃匀浆器中研磨成10%匀浆，4 ℃低温离心10 min，取上层血清，采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法测定组织超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)与丙二醛(Malondialdehyde，MDA)活性。③取大脑海马组织的样本，提取总蛋白，采用Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白相对表达水平，以β-actin作为内标。

结 果

1 各组大鼠逃避潜伏期比较 中药组、西药组给药后7、14、21 d的逃避潜伏期都低于模型组；中药组也低于西药组，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠造模后不同时间点逃避潜伏期比较(min)

2 各组大鼠海马组织形态学比较 模型组中海马区神经元大量变性、死亡，周围出现空晕，胞浆浓缩，细胞体积缩小，核固缩、碎裂明显；西药组中海马区神经元变性，神经元胞体缩小，死亡明显减轻，但形状与模型组接近；中药组中海马区神经元基本无变形，神经元胞体基本正常，细胞核圆而大，核仁清晰(图1)。

图1 各组大鼠的海马组织形态学(HE染色，×200)

3 各组大鼠SOD与MDA活性比较 中药组、西药组给药后21 d的SOD活性高于模型组，MDA活性低于模型组，相比较差异均有统计学意义(P<0.05)；中药组与西药组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠造模后21 d脑组织SOD与MDA活性比较

4 各组大鼠海马组织Bax、Bcl-2蛋白相对表达水平比较 中药组、西药组给药后21 d的Bax、Bcl-2蛋白相对表达水平高于模型组，中药组高于西药组，相比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠造模后21 d的海马组织Bax、Bcl-2蛋白相对表达水平对比

讨 论

血管性痴呆是中老年人群的常见病、多发病，同时也给患者家庭和社会带来越来越沉重的负担[12-14]。中医认为血管性痴呆的病位在脑，其本在肾，与脏腑功能失调有关，病性以瘀、火、虚、痰为主，在治疗上应以辨证与辨病相结合治疗[15-16]。本研究显示中药组、西药组给药后7、14、21 d的逃避潜伏期均低于模型组，中药组也低于西药组。中药组海马区域细胞排列比较紧密，仅见少数细胞变性、坏死，胞浆内尼氏体比较丰富。表明活血化痰胶囊可显著改善血管性痴呆大鼠认知水平，提高学习记忆功能，也可缓解海马神经元损伤[17]。

生理状态下，机体的氧化应激状态处于平衡状态；当血管性痴呆发生时，导致活性氧堆积[18-19]。SOD是在正常情况下存在于体内的重要自由基天然清除剂，血管性痴呆可使得SOD活性下降，使膜结构受损程度逐步加重。MDA是一种重要的生物大分子交联剂，可影响DNA复制与转录，导致SOD生成减少与活性降低。本研究显示中药组、西药组给药后21 d的SOD活性高于模型组，MDA活性低于模型组，中药组与西药组比较差异也有统计学意义。当前也有研究表明活血化痰胶囊可增加大鼠的下丘脑神经元钠钾电流，增加海马部位K+介导的乙酰胆碱释放，从而缓解或减轻了缺血缺氧对神经元的损伤[20-21]。还有研究表明活血化痰药物的提取物可减轻脑缺血对海马神经元的损伤，阻止及抑制海马组织神经元凋亡，从而可避免脑血管疾病患者发展成血管性痴呆[22-23]。

细胞凋亡机制中Bcl-2属于非常重要的一种调节因子，可抑制细胞凋亡[24]。已有研究显示雌二醇可能通过提高Bcl-2表达水平，减少海马神经元的凋亡，降低神经元对凋亡刺激的敏感性，达到对神经元的保护作用[25-26]。本研究显示中药组、西药组给药后21 d的Bax、Bcl-2蛋白相对表达水平高于模型组，中药组也高于对照组，提示活血化痰胶囊可能通过提高海马组织Bcl-2 表达，改善血管性痴呆大鼠的学习记忆功能。本研究也有一定的不足，活血化痰胶囊介导的脑神经保护途径比较多，本研究只分析了单一途径；且本研究没有设置空白对照，可能存在研究偏倚，将在后续研究中深入分析。

总之，活血化痰胶囊在血管性痴呆大鼠中的应用能促进海马区Bcl-2表达，缓解氧化应激反应，促使大鼠具有更好的学习记忆能力。