GLUT3在成人急性淋巴细胞白血病中的表达及意义

朱鸿燕 阳梅 何川

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一种起源于淋巴细胞的血液系统恶性肿瘤，ALL是成人中最常见的急性白血病类型[1]。成人ALL治疗方案较多并可缓解病情，但其复发率及其并发症发生率较高且对化疗药物易产生耐药性，已严重影响患者生活质量及其预后[2]。目前ALL发病机制尚未完全阐明，研究指出高血糖可导致脂代谢等多种代谢异常进而影响ALL患者预后生存时间[3]。故而相对稳定的血糖水平对提高ALL患者治疗效果及改善患者预后均具有重要意义。葡萄糖转运蛋白(glucose transporter，GLUT)可促进细胞对葡萄糖的吸收，其中葡萄糖转运蛋白-3(glucose transporter 3,GLUT3)在细胞摄取葡萄糖的过程中发挥重要作用[4]。研究表明GLUT3在子宫内膜癌等多种恶性肿瘤中均呈高表达，并可促进疾病进展，同时其与子宫内膜癌等肿瘤细胞恶性程度及患者预后不良密切相关[5]。关于GLUT3在血液系统恶性肿瘤中的研究相对较少，因此，本研究通过检测GLUT3在成人ALL患者中的表达并分析其与患者临床指标的相关性，初步探讨其在ALL发生及发展过程中的作用及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年2月至2016年3月在本院就诊的成人初诊ALL患者78例为ALL组，ALL患者均经骨髓细胞学、遗传学、免疫分型检查及分子生物学等确诊。ALL组中男40例，女38例；年龄25～55岁，平均(35.26±7.75)岁。根据免疫分型检查、骨髓细胞学及分子生物学检查结果将ALL患者分为B系ALL(B-ALL)49例，T系ALL(T-ALL)29例；Ph阳性患者15例，Ph阴性患者63例。同时选取40例非血液系统疾病患者为对照组，其中男23例，女17例；年龄19～60岁，平均(37.17±6.71)岁。2组受试者年龄、性别比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经四川大学华西医院伦理委员会批准，研究对象均知情且签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 (1)纳入标准：所有ALL患者接受化疗；年龄≥18岁；临床资料完整者；ALL患者复查时接受骨髓评价疗效者；对照组受试者均无急慢性感染或血液系统疾病。(2)排除标准：合并恶性肿瘤者；肝肾功能严重障碍者；合并自身免疫性疾病患者；合并其他系统严重疾病者；精神疾病患者。

1.3 方法

1.3.1 治疗方案及其效果评估:成人ALL患者按照《中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗专家共识》中的治疗方案进行治疗[6]，ALL患者均治疗1个疗程，治疗结束后评价其治疗效果，其中所有ALL患者初诊前均未进行化疗或ALL相关治疗，1个疗程治疗后52例ALL患者完全缓解，26例ALL患者未完全缓解。

1.3.2 骨髓单个核细胞分离:无菌环境下分别抽取所有受试者骨髓5 ml，置于抗凝试管内，按照等体积比将其加入Ficoll分离液(上海根生生物科技有限公司)，放入离心机内离心，转速为1 500 r/min，离心时间为15 min，将离心后试管中层内单个核细胞吸出并调整细胞浓度为2×106ml，置于-80℃超低温冰箱保存。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测骨髓单个核细胞中GLUT3基因表达水平:取出骨髓单个核细胞并加入细胞裂解液(上海通蔚生物有限公司)裂解，分别加入1 ml Invitrogen TRIzol试剂(美国Thermo Fisher公司)提取总RNA，利用紫外分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)检测总RNA纯度，以A260/A280≥1.80为合格RNA进行后续试验，采用逆转录试剂盒(美国Promega公司)将总RNA逆转录为模板单链cDNA，以cDNA为模板按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(日本Takara公司)进行qRT-PCR反应。GLUT3基因引物序列：正向引物5’-GTGTCTCCCACTGCCCTAC-3’，方向引物5’-GCCCAGAATAAAGTCCAAA-3’；内参基因GADPH引物序列：正向引物5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，反向引物5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。引物均由上海生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反应体系：2×定量PCR Master Mix混合液10 μl，正反向引物(终浓度分别为0.08 μmol/L)各0.08 μl，cDNA模板2 μl，Taq DNA聚合酶 0.4 μl，ddH2O 7.44 μl。每个样品均设置3个复孔。qRT-PCR反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，连续进行38次循环并分别扩增3次，GLUT3以GADPH为内参基因，采用2-ΔΔCt法分析骨髓单个核细胞中GLUT3基因相对表达量。

1.4 随访 通过查阅病例资料、复诊及电话随访等方法对ALL患者进行随访，随访截止时间为2018年12月31日，统计ALL患者从初诊至死亡或末次随访时间(总生存，OS)，并统计ALL患者治疗后从完全缓解开始至首次白血病复发或死亡或末次随访时间(无病生存，DFS)。

2 结果

2.1 成人初诊时ALL患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平 ALL组患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平显著高于对照组(P<0.05)，ALL不同分型B-ALL与T-ALL患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平显著高于对照组(P<0.05)，B-ALL与T-ALL比较差异无统计学意义(P>0.05)；ALL不同分型Ph阳性组与Ph阴性组患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平显著高于对照组(P<0.05)，Ph阳性组与Ph阴性组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 成人初诊时ALL患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平

2.2 不同治疗效果成人ALL患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平 完全缓解组ALL患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平显著低于未完全缓解组(P<0.05)。见表2。

表2 不同治疗效果成人ALL患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平

2.3 GLUT3表达与成人初诊时ALL患者临床指标的关系 根据成人初诊时ALL患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平平均值将其分为高表达组(48例)与低表达组(30例)，比较GLUT3表达与成人初诊时ALL患者临床指标的关系，结果显示GLUT3表达水平与ALL患者年龄、WBC数目、血红蛋白、髓外侵犯明显相关(P<0.05)。见表3。

表3 GLUT3表达与成人初诊时ALL患者临床指标的关系 例(%)

2.4 影响成人ALL患者预后的多因素分析 将单因素分析中对成人ALL患者OS与DFS有意义的因素纳入COX回归模型分析，结果显示年龄、白血病髓外侵犯及GLUT3高表达是影响ALL患者OS与DFS的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响成人ALL患者预后的COX多因素分析

2.5 影响成人ALL患者预后的单因素分析 将影响成人ALL患者预后的相关因素进行单因素分析，结果显示年龄、WBC数目、血红蛋白、髓外侵犯及GLUT3表达均为影响成人ALL患者预后的危险因素(P<0.05)。见表5。

表5 影响成人ALL患者预后的单因素分析

3 讨论

ALL患者体内白血病细胞恶性增殖并浸润骨髓及其他周围组织器官进而抑制正常造血功能，目前临床已有新型化疗药物治疗ALL，但早期诊断与针对性治疗ALL对改善患者预后具有重要意义[7]。因此，探寻ALL早期诊断及评估患者预后的新型指标对提高治疗效果具有重要应用价值。

GLUT3在肺癌组织中呈高表达并可通过促进癌细胞上皮间质转化进而促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭，同时GLUT3高表达与乳腺癌恶性病变存在明显相关性[8，9]。研究表明缺氧诱导因子1(HIF-1)可通过上调恶性肿瘤中GLUT3表达进而促进肿瘤发生及发展[10]。另有研究指出白血病患者脊髓缺氧微环境可促进白血病细胞增殖，缺氧环境下HIF-1表达水平升高并可促进白血病细胞分化及侵袭[11]。由此猜测成人ALL患者脊髓微环境处于缺氧状态促使HIF-1表达水平升高并可通过上调GLUT3表达进而促进白血病细胞增殖及侵袭导致病情加重。本研究检测成人ALL患者脊髓单个核细胞中GLUT3表达，结果显示ALL组患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平显著高于对照组，其中B-ALL、T-ALL与Ph阳性组、Ph阴性组患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平均显著高于对照组，说明GLUT3在成人ALL患者脊髓单个核细胞中呈高表达并可能参与疾病发生过程，但GLUT3表达与ALL不同分型无关。提示成人ALL患者骨髓微环境可能处于缺氧状态从而促使GLUT3表达水平升高导致疾病严重程度增加。同时成人ALL患者经1个疗程治疗后分为完全缓解组与未完全缓解组，结果发现完全缓解组ALL患者骨髓单个核细胞中GLUT3表达水平显著低于未完全缓解组，提示GLUT3表达水平可能与成人ALL患者化疗效果有关并可能促使化疗耐药性的发生。

年龄、WBC数目、血红蛋白、是否发生髓外侵犯等均为ALL患者临床指标并与患者预后密切相关[12]。本研究根据成人ALL患者初诊时GLUT3表达水平平均值将其分为高表达组与低表达组，分析其与ALL患者临床指标的相关性，结果显示随着ALL患者年龄的增加、WBC数目增多、血红蛋白含量增加及白血病细胞发生髓外侵犯GLUT3表达水平明显升高，提示GLUT3可能参与成人ALL发展过程。同时GLUT3还与神经胶质瘤细胞增殖、侵袭及迁移密切相关，并与肿瘤病理分期及患者预后有关[13，14]。研究指出ALL患者年龄越高其OS与DFS生存时间越低，WBC数目越高ALL患者OS与DFS越低，是否伴有白血病细胞髓外侵犯均可作为预测ALL患者预后的重要指标[15]。本研究采用单因素分析法对影响成人ALL患者预后的相关因素进行分析，结果显示年龄、WBC数目、血红蛋白、髓外侵犯及GLUT3表达均为影响成人ALL患者预后的危险因素，进一步采用COX回归模型进行多因素分析，结果显示年龄、白血病髓外侵犯及GLUT3高表达是影响ALL患者OS与DFS的独立危险因素，提示成人ALL患者骨髓单个细胞中GLUT3表达水平可作为评估患者预后潜在的重要指标。

综上所述，成人ALL患者骨髓单个细胞中GLUT3呈高表达并可参与该疾病发生及发展过程，其与ALL患者临床指标及化疗耐药密切相关，并可能作为评估成人ALL患者预后的重要指标，可为成人ALL治疗提供新型靶点。但GLUT3在成人ALL发生及发展过程中的具体作用机制有待深入研究。