不同人群新型冠状病毒核酸检测的临床价值

胡亚会，郑 阳，李莹莹，陈 军，孟婧洁，闫 琛，宋银森

(郑州人民医院转化医学研究中心，河南 郑州 450015)

2019年12月以来，我国湖北省武汉市发现一种以发热、肺部感染为主要症状的传染性疾病，随后在全国各省市地区发现类似疾病。2020年1月7日，中国疾病预防控制中心从患者的咽拭子标本中鉴定出一种新型冠状病毒，最初被世界卫生组织(WHO)命名为2019-nCoV[1-3]。1月30日，世界卫生组织(WHO)宣布新型冠状病毒肺炎疫情构成国际关注的突发公共卫生事件[4]。2月11日，WHO将这种疾病重命名为2019冠状病毒病(COVID-19)，引起该疾病的病毒为新病原体，重新命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。目前，COVID-19呈现出全球范围内流行趋势，截至4月1日10时，我国确诊病例82 617例，境外输入病例771例；除我国以外，全球已有200个国家和地区774 494例确诊病例[5]。

SARS-CoV-2为β属冠状病毒，是单股正链RNA病毒，在此之前流行的人冠状病毒主要有6种，分别为α-冠状病毒的HCoV-229E和HCoV-NL63，β-冠状病毒的HCoVOC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。其中，SARS-CoV、MERS-CoV和 SARS-CoV-2均表现为严重的下呼吸道感染[6]。SARS-CoV-2可通过飞沫、接触和气溶胶传播，与2003年流行的SARS-CoV相比，SARS-CoV-2致死率相对要低(4%)，但隐性感染者和轻症病例较多，使得传播更为广泛[7-8]。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测呼吸道标本SARS-CoV-2核酸检测和高通量测序发现SARS-CoV-2基因均为确诊COVID-19的金标准。但是，高通量测序耗时长、成本高、对检测人员和仪器要求高，不能满足大规模标本检测的临床需求。RT-PCR病毒核酸检测具有简便快速、特异性高、成本较低、易于操作等优点，可以广泛应用于临床[9]。本文采用RT-PCR方法对发热门诊、隔离病区患者、本院一线疫情防控医护人员、未出现COVID-19症状的住院患者、陪护家属和大范围筛查复工前体检人群进行检测，为临床SARS-CoV-2核酸检测提供实验室参考。

1 对象与方法

1.1 标本来源 收集2020年2月1日—3月22日郑州人民医院(河南省郑州市COVID-19定点检测和收治医院)发热门诊、隔离病房疑似和确诊COVID-19患者(共2 685例)的咽拭子标本，同时采集本院疫情防控一线医护人员、所有未出现COVID-19症状的住院患者、陪护家属和复工体检人员的咽拭子标本。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂与仪器 采用两种试剂盒对发热门诊和隔离病房检出的所有阳性标本和确诊COVID-19患者治疗后复查标本进行检测，分为A组和B组，其余送检标本只用其中一种检测试剂盒。A组采用上海之江生物新型冠状病毒核酸快速检测试剂盒(RT-PCR)，病毒RNA提取采用EX3600核酸提取仪(上海之江生物)。B组采用湖南圣湘生物新型冠状病毒核酸快速检测试剂盒，不需提取病毒RNA直接按照说明书配制反应体系并扩增产物。两组均采用美国Thermo Fisher Scientific ABI7500型荧光定量PCR仪对PCR产物进行扩增。

1.2.2 检测方法 所有标本先56℃灭活30 min预处理后再进行RT-PCR检测。A组需提取病毒RNA，严格按照之江试剂说明书进行提取，标本混匀后，吸取300 μL标本(咽拭子病毒保存液或血清标本)采用磁珠法获得50 μL的病毒总RNA溶液。按照两种厂家试剂说明书设置反应程序，A组检测SARS-CoV-2开放读码框1ab(open reading frame, ORF1ab)、核壳蛋白(nucleoprotein, N)基因和包膜蛋白(envelope protein, E)基因三个位点，B组检测SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因两个位点。

1.2.3 结果判读 两组检测试剂均含内源性监测系统(内标，IC)，用于监控核酸提取及扩增过程，每次试验均设置阴性和阳性对照。结果分析时首先查看内标通道是否有扩增曲线，扩增产物的荧光信号是否达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数(cycle threshold，Ct)，同时检查质控品结果是否合格。以上要求均满足说明试验有效，如果有一条不满足则为无效需重新检测。A试剂PCR产物扩增结果判定为阳性(Ct值≤43，典型S扩增曲线)，阴性(Ct值>43或无扩增曲线)；B试剂PCR产物扩增结果判定为阳性(Ct值≤40，典型S扩增曲线)，阴性(Ct值>40或无扩增曲线)。

1.3 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件对所有数据进行分析，计数资料采用例数或百分比表示，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 易感人群及大范围筛查结果 共检测本院一线疫情防控医护人员、所有未出现COVID-19症状的住院患者、陪护家属和复工体检人员咽拭子标本12 812份，所有标本SARS-CoV-2核酸检测均为阴性。见表1。

表1 易感人群及大范围筛查人员咽拭子SARS-CoV-2核酸检测结果(份)

2.2 发热门诊患者和隔离病房患者核酸检测结果 共检测发热门诊、隔离病房患者2 685份咽拭子标本，其中核酸阳性24份(0.89%)，阴性2 661份(99.11%)；24例咽拭子SARS-CoV-2核酸阳性患者同时送检的血标本，SARS-CoV-2核酸检测结果呈阴性。咽拭子SARS-CoV-2核酸阳性患者中年龄12～86岁，中位数为47岁；男性患者13例(54.17%)，女性患者11例(45.83%)。见表2。

表2 发热门诊、隔离病房患者咽拭子SARS-CoV-2核酸检测结果[例(%)]

2.3 两组试剂盒首次核酸检测阳性结果 24例SARS-CoV-2核酸阳性咽拭子标本，两组试剂首次核酸检测均为阳性。A组试剂病毒 ORF1ab基因、N基因和E基因三个位点均呈典型S扩增曲线，B组试剂病毒 ORF1ab基因无扩增曲线、N基因呈典型S扩增曲线。见图1。

A为之江试剂，B为圣湘试剂。

2.4 两组试剂复查核酸检测结果 24例确诊COVID-19患者治疗后复查SARS-CoV-2核酸时，2例患者咽拭子标本A组试剂检测结果均为阳性，且SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因和E基因三个位点均呈S扩增曲线，B组试剂检测结果均为阴性(见图2、3)；其余22例患者咽拭子标本两组试剂检测结果一致。

A为之江试剂，B为圣湘试剂。

A为之江试剂，B为圣湘试剂。

3 讨论

根据SARS-CoV-2核酸检测专家共识要求，SARS-CoV-2核酸检测应在经过严格生物安全评估的二级生物安全实验室进行，检测人员均执行三级生物安全防护[10]。采集咽拭子方法为在咽峡深部(悬雍垂及扁桃体两侧)利用植绒拭子反复刮取，采集后立即将拭子头浸入含3 mL的病毒保存液管[11]。实时荧光定量RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸很少出现徦阳性，但是阳性患者的阳性率相对较低(30%～50%)，所以疑似病例需经过多次核酸检测提高阳性率。本研究结果显示，发热门诊、隔离病房患者SARS-CoV-2核酸阳性率为0.89%，与海南三亚某医院的阳性率相当[12]。核酸检测结果容易出现假阴性，除了试剂影响因素外，可能还与病毒本身的变异、采集样本时间、标本质量、检测人员操作水平、仪器设备等因素有关[13]。

实时荧光定量RT-PCR技术的特异性和敏感性均较高，可用于各种类型生物标本的检测，如痰、呼吸道分泌物、血、尿和粪便等，对疾病早期诊断和治疗效果监测具有重要的临床指导价值，尤其对于无症状感染者的早期发现更为重要[14]。对所有本院一线疫情防控医护人员、未出现COVID-19症状的住院患者、陪护家属等易感人群进行筛查，可以防范医患、陪护和探视人员之间的交叉感染，有利于全院疫情防控工作的顺利进行[15]。目前，全国范围工业企业平均复工率约为98.6%，复工人员进行SARS-CoV-2核酸筛查，可大幅度缩短医学观察时间，保障复工复产过程中的疫情防控需要。

本研究SARS-CoV-2核酸阳性标本均来自于咽拭子，24例咽拭子检测核酸阳性患者，其同时送检的血标本SARS-CoV-2核酸检测均为阴性，与施绍瑞等[16]研究结果一致。可能原因为：(1)所有确诊病例均为轻型和普通型，未发现重型/危重型病例，不能代表所有类型确诊患者的检测结果；(2)纳入的确诊患者病例数相对较少，样本量有限。本研究24例确诊COVID-19患者男女性别比为1.18∶1，对全国72 314例确诊COVID-19病例研究发现男女比例为1.06∶1[17]，上海市某三甲医院14例COVID-19确诊患者的男女比例为1.33∶1[18]，基于以上数据推测可能样本量越大男女比例越接近1∶1。本研究发现，确诊COVID-19患者年龄中位数为47岁，62.50%的患者年龄集中在20～60岁，与相关文献[12,17-18]研究结果虽有所差异，但均提示年龄与COVID-19的感染相关，中老年人群更易感染。

目前，国家药品监督管理局(NMPA)批准的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒中大多数采用实时荧光定量RT-PCR，且均采用Taqman探针[19]。本研究比较了两种国产试剂盒核酸检测结果，发现两种试剂对阳性咽拭子标本核酸检测能力差别不大，但A试剂检测病毒ORF1ab、N和E三个基因位点，B试剂只能检出病毒N基因位点。对COVID-19患者治疗后复查SARS-CoV-2核酸结果Ct值接近阳性临界值的咽拭子标本，A试剂的检测能力要优于B试剂。分析原因可能是：(1)由于此次疫情属于突发公共卫生事件，试剂盒在研发过程中尚无足够的临床标本和时间进行完整的性能验证，尤其是对于检出限和灰区的临床验证，各厂家核酸检测试剂盒质量的稳定性和可靠性需要不断优化；(2)由于本研究纳入的确诊患者病例数较少，样本量有限，并不能代表2种试剂的整体检测性能[20]。

此外，本研究发现与首检咽拭子标本的Ct值相比，24例确诊COVID-19患者经治疗后复检咽拭子样本的Ct值，大多数有所下降，表明随着临床症状的缓解，病毒载量在患者体内亦有所下降。当临床症状完全消失，连续两次复检咽拭子SARS-CoV-2核酸阴性，可作为临床治愈出院标准。目前，在本院治疗的24例确诊COVID-19患者中，初诊均为轻型和普通型；其中23例从入院开始病情逐渐好转直至治愈出院，1例初诊轻型患者治疗1周后病情加重转为重型，改变方案继续进一步治疗后治愈出院。后续将持续进行出院患者的追踪随访，健康指标监测，以便进一步认识COVID-19。

本研究对发热门诊和隔离病房患者、易感人群以及大规模筛查人群进行SARS-CoV-2核酸检测，发现SARS-CoV-2核酸检测对于COVID-19患者的临床诊疗和控制疫情进展有非常重要的价值。分析两个部位生物标本的核酸检出阳性率和两种不同厂家试剂的检测能力，为SARS-CoV-2实验室核酸检测提供参考依据。本研究的局限性在于未对24例确诊COVID-19病例做临床和流行病学特征分析，不能为制定疫情防控策略和措施提供科学依据，下一步将重点分析确诊COVID-19病例的临床和流行病学特征。