坎地沙坦与卡托普利对1型糖尿病小鼠主动脉活性氧水平的影响

刘 畅，张正浩，许世清

（中日友好医院 临床医学研究所，北京 100029）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）大血管病变的基础是动脉粥样硬化，其发生机制目前国内外的共识认为，主要包括内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS） 解偶联所引起的血管内一氧化氮（nitric oxide，NO）减少和超氧化物的含量增多而继发血管内皮功能障碍[1，2]。目前，临床上广泛应用的DM 降压药物包括血管紧张素转化酶抑制剂（angiotension-converting enzyme inhibitor，ACEI） 或血管紧张素受体拮抗剂（angiotension Ⅱreceptor antagonist，ARB）。关于卡托普利与坎地沙坦是否能够减轻DM 大血管氧化应激水平，以及对eNOS 功能障碍的影响国内外尚未见相关深入报道。本研究旨在评估卡托普利与坎地沙坦对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的Ⅰ型DM 小鼠主动脉氧化应激水平以及eNOS 解偶联的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性C57BL/6J 小鼠，5～6 周龄 （北京华阜康生物科技股份有限公司），实验动物饲养于中日友好医院临床医学研究所医学实验动物平台，室温保持在25±1 ℃，湿度保持在55%±5%。动物自由摄食，自由饮水，保持规律的12h 昼夜循环。开始实验前，动物正常饮食饮水，适应性饲养1 周。

1.2 试剂与仪器

One-Touch I 稳豪倍易血糖仪及试纸美国（Johnson & Johnson），超氧化物阴离子荧光探针DHE（Sigma，美国），L-NAME（Cayman，美国），坎地沙坦（上海源叶生物），卡托普利（Sigma，美国），Krebs-Henseleit（K-H）溶液（mmol/L）：NaCl 119，NaHCO325，MgCl21.19，KCl 4.7，KH2PO41.2，Ca-Cl2 2.5，D-Glucose 11.1。激光共聚焦扫描显微镜（Nikon，日本）。

1.3 标本取材

小鼠灌胃给药3d 后，戊巴比妥麻醉，注入4℃预冷的生理盐水反复灌洗主动脉，取主动脉，在显微镜下小心去除周围脂肪组织，截取3mm 的血管环，OCT 包埋剂包埋后用冰冻切片机切片，切片厚度10μm。

1.4 实验设计与分组

健康小鼠30 只，随机分成正常对照组（NC）和模型组。NC 组4 只，模型组26 只。小鼠禁食12h，但随意饮水，然后以100ml/kg 的剂量连续3d向小鼠腹膜内注射STZ 溶液（浓度12mg/ml）[3]。注射时将STZ 粉末溶于pH 4.5 的冰冷的0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液中，避光冰上配置。注射STZ 后72h，血糖可稳定升高，以随机血糖≥16.7mmol/L作为1 型DM 建模成功的标准。成模小鼠共26只，随机分为3 组。DM 对照组（DM）：每天用生理盐水灌胃1 次； 坎地沙坦干预组 （DM+CAD）：100mg/kg/d 药物灌胃3d；卡托普利干预组（DM+CAP）：100mg/kg/d 药物灌胃3d。小鼠分笼饲养，自由饮水，普通饲料喂养。

1.5 血糖测定

测定血糖时进行尾静脉取血，滴在血糖试纸上，利用血糖仪测定血糖水平。

1.6 超氧化物阴离子荧光探针（dihydroethidium，DHE）法检测O2-水平

将冰冻切片于室温下晾干，用PBS 冲洗切片5min 后甩干液体。一部分切片加入eNOS 抑制剂（nitro -L -arginine methyl ester，L -NAME）7μm 37℃条件下在避光预孵育30min，预孵育结束后将所有切片加入DHE （2μm），37℃条件下避光孵育30min，用蒸馏水冲洗切片1min，重复3 次。在激光共聚焦显微镜下观察荧光，每个标本选取3个高倍视野 （×400），相对荧光强度反映反应性ROS 水平，相对荧光强度为处理组平均荧光强度相对未处理组的比值，平均荧光强度为同组多个荧光强度的均数。正常组和DM 组的处理和成像使用相同参数平行进行，应用Imagine J 软件进行图像分析。

图1 正常对照组与模型组小鼠主动脉超氧阴离子（）水平

图2 加入L-NAME后各组别小鼠主动脉超氧阴离子（）水平

图3 不同组别主动脉相对荧光强度的变化

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 实验动物一般情况

正常组小鼠精神状况良好、反应灵敏、毛色光亮、进食水及尿量正常，体重稳定增长；DM 造模组小鼠则出现精神萎靡、反应迟钝、多饮、多食、多尿及体重下降等典型特征。实验结束时造模组小鼠体重略低于对照组，但实验前后动物体重在四组间均无显著差异。

2.2 注射STZ 后小鼠血糖的变化

NC 组 小鼠血 糖正 常；DM 组、DM+CAD 组、DM+CAP 组血糖明显升高 （＞16.7mmol/L）。造模前，NC 组与模型组血糖均正常，差异无统计学意义。注射STZ 72h 后，与NC 组相比，模型组小鼠血糖明显升高，差异有统计学意义（9.53±0.67 vs 22.16±1.41，P<0.01）。

2.3 超氧阴离子（O2-）水平

各组小鼠主动脉中O2-检测结果显示，模型组的DHE 荧光信号显著高于对照组 （图1，见封二），证实STZ 诱导的1 型DM 小鼠主动脉内活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量增加，氧化应激水平明显增高（P<0.05，图3）。而CAD 组、CAP 组小鼠主动脉中ROS 生成量明显减少，主动脉红色荧光强度明显减弱（图1，见封二）。对MFI的分析结果显示，与DM 组比较，DM+CAD 组、DM+CAP 组小鼠主动脉组织中ROS 生成量均明显减少（均P<0.05，图3）。给予eNOS 阻断剂LNAME 孵育后，与未孵育相比，NC 组小鼠荧光强度增高（图2，见封二），分析结果有统计学意义（P<0.05，图3），DM 组小鼠荧光强度减弱（图2，见封二），分析结果有统计学意义（P<0.05），而DM+CAD 组和DM+CAP 组荧光强度增高（图2，见封二），可逆转这一表型（P<0.05，图3）。

3 讨论

据估计，到2035年，2013年全球3.82 亿人的DM 患病率将升至5.92 亿[4]。DM 并发症以慢性病较为常见，表现为大血管病变、 微血管器官病变等。大血管并发症包括心血管疾病，比如冠心病、中风以及外周血管疾病。据相关报道，DM 患者中超过75%的死亡是由心血管疾病引起的[5]。因此，抑制和减轻大血管并发症已成为DM 治疗中的主要挑战。长期的高血糖状态引起多系统代谢紊乱，导致大血管及微血管的病变，严重威胁患者身体健康。一氧化氮合酶与DM 主动脉损伤有着密切联系。NOS 包括3 种亚型，神经元型（nNOS），诱导型（iNOS），和内皮型（eNOS）[6]。eNOS 在血管内皮细胞中组成型表达，在正常生理状态下产生的NO 能够起到扩张血管的作用。在DM 条件下，eNOS 功能障碍解离为单体，不能产生NO 而是产生大量O2-，O2-与NO 结合生成大量ONOO-，对血管内皮细胞进而产生细胞毒作用[7]。现普遍认为，在DM 早期阶段，高血糖状态诱导肾小球高滤过和尿钠排泄，激活了Ang Ⅱ的合成作为代偿机制维持正常血压[8]，由于DM 时血浆及组织中AngⅡ浓度升高，Ang Ⅱ通过与血管紧张素Ⅰ型受体（AT1-R）结合，激活NAD（P）H 氧化酶，促进ROS的产生，进而促进氧化应激和炎症反应，损伤内皮功能，引起血管慢性炎症、纤维化、凋亡以及动脉硬化等病理改变，而ROS 水平升高又是造成eNOS 脱偶联的主要原因[9]。激活的RAS 通过改变血流动力学，促进主动脉平滑肌细胞增生，加重炎症反应和氧化应激等多种机制，进而诱发动脉粥样硬化。抑制RAS 的药物作为常用降压药在临床上广泛使用，Ang Ⅱ拮抗剂包括ACEI 和ARB 类药物。肾素作为激活的激素释放，控制肾脏，钠和体内稳态。肾上腺肾小球细胞响应各种刺激（包括降低的肾脏灌注压力，交感神经激活和减少的黄斑部小管钠传递）而产生肾上腺素。该酶级联反应从循环的（主要是肝脏的）血管紧张素原开始产生相对无活性的十肽血管紧张素Ⅰ（Ang Ⅰ），然后非特异性酶血管紧张素转换酶（ACE）从AngⅠ转变为Ang Ⅱ。除了产生Ang Ⅱ，ACE 分别催化缓激肽的降解[10]。因此，用ACE 抑制剂（ACEI）药物进行的治疗会导致缓激肽积聚并抑制Ang Ⅱ[11]。卡托普利是人工合成的非肽类血管紧张素转化酶抑制剂，通过作用于肾素-血管紧张素-醛固酮系统，同时其分子基团上的巯基还能够有效地保护血管内皮细胞，在降低心血管死亡率方面发挥了重要的作用。坎地沙坦是选择性血管紧张素受体拮抗剂，是继ACEI 后又一类作用于RAS 的降压药物，其阻断RAS，抑制了Ang Ⅱ诱导的氧化应激，具有更加长效、平稳等特点。Ang Ⅱ激活两种类型的血管紧张素Ⅱ受体即ATR Ⅰ和ATR Ⅱ。ATR Ⅰ受体在血管，脑，心脏，肾脏，肾上腺和神经中含量丰富，而ATR Ⅱ在胎儿中显著表达，但在产后期间数量减少。ATR Ⅰ的激活会增加三磷酸肌醇和各种花生四烯酸代谢产物，并降低环状单磷酸腺苷。这会导致血管平滑肌收缩引起的全身血管收缩，醛固酮增加，导致近端小管对钠的重吸收增加。血管紧张素Ⅱ还促进儿茶酚胺从肾上腺髓质和神经末梢的释放，引起交感神经系统亢进。因此，拮抗ATRⅠ会导致心脏后负荷和预负荷的降低，ARB 的抗高血压特性主要归因于周围血管阻力的降低[10]。

目前检测超氧阴离子的方法包括化学发光法、 荧光分析法、 酶学分析法以及电子顺磁共振（EPR）。DHE 可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS 氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可掺入染色体DNA 中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS 含量的多少和变化。DHE 在荧光分析法中具有特异性强，保存时间相对较长的优点。

在这项研究中，我们建立了STZ 诱导的1型DM 小鼠模型，研究了坎地沙坦与卡托普利这2种药物对小鼠主动脉的氧化应激水平及eNOS 功能障碍的影响。通过测量有或没有与L-NAME 一起孵育的DHE 的荧光水平来评估主动脉切片中eNOS 的解偶联。结果显示，1 型DM 成模小鼠主动脉出现氧化应激，给予Ang Ⅱ拮抗剂坎地沙坦和卡托普利药物干预后，显著降低了eNOS 衍生的超氧化物产生，氧化应激水平明显下降。LNAME 孵育后，正常对照组小鼠的主动脉荧光水平增高，表明NO 与超氧阴离子相互作用的有效性降低。DM 组小鼠的主动脉氧化应激水平降低，这表明eNOS 解偶联是DM 小鼠主动脉内皮中ROS 的来源。给予AngⅡ拮抗剂坎地沙坦和卡托普利药物干预后，可逆转这一表型。

本研究结果提示，Ang Ⅱ作用于eNOS 解偶联可能揭示了血管疾病中eNOS 功能障碍的常见机制。坎地沙坦和卡托普利通过改善eNOS 功能可能对于1 型DM 大血管病变的发生发展有一定延缓作用，能够显著降低主动脉氧化应激水平，对大血管并发症有一定的预防作用。