饲粮中添加苹果渣对伊拉肉兔盲肠微生物多样性的影响

冯国亮 郑建婷 曹 亮 牛晓艳 李燕平 唐耀平 任克良

（山西农业大学动物科学学院，山西太原030032）

随着我国苹果产量的逐年增加，大量的苹果渣被废弃，对环境造成压力。据研究苹果渣富含多种营养物质，适口性好，具有较高的营养价值[1]。优质粗饲料资源短缺长期以来阻碍了家兔业的发展，合理利用苹果渣不仅能变废为宝，同时可以缓解家兔粗饲料资源短缺的难题，有利于家兔生产的健康发展。许多研究表明苹果渣可以提高肉兔生长性能，改善胃肠道环境，降低腹泻率[2-3]。通过前期试验发现，添加适宜比例的苹果渣可以显著提高断奶肉兔生长性能，降低料肉比，提高肉兔对中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的消化率，并且对兔肉品质无不良影响[4]。相关研究同时表明，添加高水平的苹果渣对粗蛋白质消化率产生不利影响，但可提高粗纤维的消化率[5-8]。目前没有添加苹果渣对断奶肉兔盲肠微生物影响的报道，为了更深入地研究苹果渣对肉兔生产性能、养分利用的影响机制，从肠道微生物的角度探究苹果渣对肉兔的影响，开展了添加不同水平的苹果渣对肉兔盲肠菌群多样性的影响，探讨肉兔饲粮中苹果渣的最适添加比例，为家兔生产中苹果渣的合理利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用苹果渣来自山东省烟台市，其营养成分见表1。试验兔为100只体重相近的32日龄断奶伊拉肉兔。

表1 苹果渣营养成分含量（风干基础）

1.2 试验饲粮

参考我国建议的家兔营养供给量[9]，选用玉米、豆粕、麸皮、苹果渣、葵花皮等原料配制试验饲粮，饲粮组成及营养水平见表2。

表2 饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.3 试验设计与试验兔饲养管理

选择100 只健康的32 日龄的断奶伊拉肉兔作为试验动物，随机分成5组，每组20个重复，每个重复1只兔。分别饲喂含不同水平苹果渣（0、6%、12%、18%和24%）的饲粮。试验期为30 d。试验前对兔舍及试验用具进行清洗，消毒；按照试验兔场常规免疫程序免疫接种。试验兔单笼饲养。兔舍自然采光、通风。每日08：00、17:00进行饲喂，自由饮水。

1.4 样品采集

试验结束时，每个试验组随机采集5只试验兔的盲肠内容物，装入无菌的5 ml 冻存管中，迅速投入液氮中，随后转入-80 ℃冰箱保存待测。

1.5 肠道微生物基因组提取及测序

使用环境样本DNA提取试剂盒进行基因组DNA抽提后，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。随后将DNA 样品测序分析（由成都安诺微生物检测公司完成），采用PE250测序方式，测序试剂盒使用Illumina 公司Hiseq Rapid SBS Kit v2 (FC-402-4023 500 Cycle)。

1.6 数据处理

双端测序得到的PE reads 首先使用FLASH 进行拼接，使用QIIME 软件将拼接之后的序列按照barcode 标签区分，去除低质量序列，在97%的相似性水平上使用UPARSE 算法进行操作分类单元OTU（Operational Taxonomic Units）的聚类，挑选出OTU的代表性序列。使用Uchime 去除嵌合体，并基于Silva 数据库对OTU 进行分类学注释。基于OTU 聚类分析结果，使用QIIME、Mothur 和R 等软件对样本进行Alpha 多样性分析、Beta 多样性分析和群落结构的差异性分析。采用SPSS 19.0 统计软件的Anova 方法对数据进行单因素方差分析，用Duncan's 法进行多重比较，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA基因测序结果质量分析

2.1.1 样品测序结果

采用Illumina Hiseq 测序平台对5 组盲肠内容物样本中16S rDNA基因的V4区进行检测，25个样品测序共得到856 712 条长度约316 bp 的序列，总碱基数270 720 992 bp。

2.1.2 各组试验兔盲肠微生物OTU的基础分析

在97%的相似水平下对OTU进行生物信息统计分析，将5组样品的有效序列进行聚类，共得到2 010个OTU，5组OTU数目分别为1 301、1 358、1 149、1 217、1 231个。由图1可知，5组共有OTU数目为693个，对照组与各试验组特有的OTU数目分别为174、228、43、47、42个。随着苹果渣添加水平的增加，对照组与各试验组共有OTU数从894个（97.68%）增加到951个（98.36%），并且对照组与Ⅲ组、Ⅳ组共有OTU数相对稳定。

2.1.3 稀释曲线

由图2 可知，序列稀释曲线（图2 上）显示并未达到饱和，但是Shannon 指数多样性分析证明当前的序列稀释度已达到饱和（图2下），结果表明样品DNA中大部分多样性的细菌已经被获得，所测的序列足以覆盖群落物种组成，能够真实反映群落各物种间的相对比例关系。

图1 苹果渣对肉兔盲肠微生物OTU的影响

图2 所有样品的Shannon指数与稀释曲线

2.2 菌群多样性分析

2.2.1 α多样性分析

α多样性是对单个样品中物种多样性的分析。样品的Chao1值在生态学中常用来估计物种总数，Shannon指数用来估算样本中微生物多样性，数值越大，说明群落多样性越高。Simpson指数常用来定量描述一个区域的生物多样性，数值越高代表多样性越高。由表3可知，盲肠内微生物菌群的多样性随着苹果渣添加量的增加呈现先降低再增加的趋势，试验Ⅳ组多样性最高。

2.2.2 β多样性分析

对添加不同水平苹果渣后试验兔盲肠微生物群落进行PCoA 分析（见图3）和非度量多维尺度分析（NMDS）（见图4），用来研究各样本群落组成的差异性，图中不同颜色或形状的点代表不同的样本。图中各样品点之间距离越近，表明样本之间微生物群落构成越相似，差异越小。由图3、图4 可知，试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组样本之间聚集度较高，说明添加适量的苹果渣对试验兔盲肠微生物群落构成差异影响不大。

2.3 菌群结构和组成

表3 盲肠微生物α多样性指标

图3 试验兔盲肠微生物群落构成的PCoA图

图4 试验兔盲肠微生物群落构成的NMDS图

表4 试验兔盲肠微生物群落在门水平上的分布(%)

2.3.1 不同苹果渣添加水平，在门的分类水平上试验兔盲肠微生物的变化

由表4可知，25只试验兔盲肠微生物均主要由厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、拟杆菌门（Bacteroidetes）及变形菌门（Proteobacteria）这四种菌门组成。5个组这4种菌门共占盲肠微生物的比例达到98.83%、98.31%、99.03%、99.06%和99.08%，且添加不同比例的苹果渣与对照组相比，各菌门相对丰度差异均不显著（P＞0.05)。在本试验中，各组试验兔盲肠微生物中相对丰度最大的优势菌门为厚壁菌门。

2.3.2 不同苹果渣添加水平，在科的分类水平上对试验兔盲肠微生物的影响

图5 是科水平上25 只试验兔盲肠微生物构成的柱状图。在科水平上，试验兔盲肠微生物中瘤胃菌科、疣微菌科、毛螺旋菌科、克里斯滕森菌科、拟杆菌目S24-7群和弧菌科相对丰度较高。结果显示，添加不同比例的苹果渣与对照组相比，各菌科相对丰度差异均不显著（P＞0.05)。但随着苹果渣添加量的增加，毛螺旋菌科(P=0.059 7)与克里斯滕森菌科(P=0.076 4)的相对丰度有增加的趋势。

图5 科水平上试验兔盲肠微生物群落结构分布

2.3.3 不同苹果渣添加水平，在种属水平上试验兔盲肠微生物丰度及差异性分析

以种属分类水平上丰度大于1%作为优势菌属的划分依据[10]。如表5 所示，对照组及不同试验组试验兔盲肠内优势菌属分别为16、16、15、17、16 种。对照组与各试验组之间有显著差异的菌属共有两种，均属于厚壁菌门，其中一种毛螺菌科未定义菌属，以试验Ⅳ组最高，显著高于对照组及其他试验组（P＜0.05）；试验Ⅱ组、Ⅳ组瘤胃球菌科UCG-010 属的相对丰度极显著高于对照组和试验Ⅰ组（P＜0.01）；添加苹果渣对其他菌属相对丰度没有显著影响（P＞0.05）。

3 讨论

近几年，我国苹果产量逐年增高，2017 年我国苹果年产量达到世界苹果总产量的57%。伴随着苹果加工业的迅速发展，大量苹果渣废弃后对环境造成很大的影响，据统计，每加工1 000 kg 鲜苹果可产生150～200 kg苹果渣。苹果渣主要包含果皮、果核和残余果肉，因此营养丰富、适口性好，同时苹果渣含有丰富的蛋白质、碳水化合物、可溶性糖及有机酸、维生素、矿物质等多种营养成分，营养价值颇高[11]。其含有的酸性物质可以调节幼年动物胃内pH，刺激胃腺，从而改善胃内环境，提高胃内消化液的分泌，促进胃肠道对养分的消化、吸收，有利于幼年动物的健康。盲肠微生物群落是在长期进化过程中形成的，与宿主保持相对平衡的稳定状态，宿主和微生物菌群的平衡共生可促进动物机体的健康、提高生产性能，打破平衡就容易导致肠道疾病发生[12-13]。因此有必要对添加苹果渣对伊拉肉兔盲肠微生物的影响进行进一步的研究。

近年来，高通量测序成为研究盲肠微生物多样性的主要手段。本试验通过测序结果表明，添加苹果渣对试验兔盲肠微生物群落构成差异影响不大，在门水平上，相对丰度最大的优势菌门为厚壁菌门，其次是疣微菌门、拟杆菌门及变形菌门，这与许多研究家兔盲肠微生物的结果相一致[14-17]。本试验发现与对照组相比，添加苹果渣提高了拟杆菌门的比例，降低了变形菌门的比例。拟杆菌是家兔肠道中主要有益菌[18]，变形菌门是细菌中最大的一门，虽然在盲肠微生物群落中占的比例很小，但其包括很多病原菌，如本试验测序得到的与肠道炎症有关的脱硫弧菌属、嗜胆菌属及大肠杆菌等[19]。Wilkowska等[20]通过体外试验发现，添加苹果渣可以减弱病原菌对小肠细胞的附着。本试验中随着苹果渣添加水平的增加，变形菌门丰度先减少后增加，这与前期饲养试验中随着苹果渣添加量的增加，试验兔腹泻率先降低后升高的结果相一致[4]。由此推测，饲粮中添加苹果渣，可能会通过影响变形菌门中一些病原菌的丰度，从而对肉兔肠道健康造成影响。在科水平上，各试验组盲肠微生物均以瘤胃菌科、毛螺旋菌科相对丰度最高，随着苹果渣添加量的增加，毛螺旋菌科与克里斯滕森菌科的相对丰度有增加的趋势。研究发现，克里斯滕森菌科受宿主遗传背景影响很大，其可显著影响小鼠体内脂肪代谢[21]，苹果渣对这一菌科的影响还有待于进一步的研究。毛螺旋菌科是盲肠内参与发酵的主要菌，具有降解半纤维素的能力[22]。在属水平上，与对照组相比，一种毛螺旋菌科未定义菌属的比例随着苹果渣添加水平的增加而增加，以试验Ⅳ组最高，显著高于其他组，因此添加苹果渣对这个未定义菌属比例的显著影响还有待于进一步的研究。另外，添加一定比例的苹果渣瘤胃球菌科UCG-010 属的比例极显著增加，以第Ⅳ组最高。前人的研究表明，瘤胃菌科微生物与纤维降解密切相关，是一类典型的纤维降解菌[23]。张雪娇等[24]研究发现，随着饲粮NDF 水平的增加，山羊瘤胃菌科微生物的增殖加强，进而证实瘤胃菌科微生物与瘤胃纤维降解密切相关。Patra 等[25]研究也证实瘤胃菌科微生物的比例与纤维降解能力显著相关，这些研究均与本试验结果一致。

表5 不同苹果渣添加水平试验兔盲肠微生物群落在属水平上的分布(%)

4 结论

饲粮中添加苹果渣可以改变生长肉兔盲肠中一些具有发酵功能的菌属的丰度，从而影响生长肉兔盲肠微生物的多样性。苹果渣作为一种优质粗饲料资源，在本试验条件下，添加24%的苹果渣对伊拉肉兔盲肠微生物无不利影响。