中晚期NSCLC患者3种不同组织中DNA修复基因XRCC3多态性检测结果比较

许超，邱黎霞，张漫，罗雪平，李荆，郭满盈(中国人民解放军陆军第72集团军医院检验病理科，浙江湖州 313000)

DNA修复基因——X线修复交叉互补基因3(XRCC3)是单链断裂修复系统的主要调节基因；研究表明，在含铂类化疗方案治疗的肺癌、结直肠癌、胃癌、宫颈癌等肿瘤患者的病灶组织中XRCC3能够修复DNA损伤，诱发铂类耐药[1]，故而检测XRCC3基因多态性对NSCLC患者化疗方案的选择具有重要的临床应用价值。肿瘤组织进行DNA分析是目前检测XRCC3基因多态性最可靠的方法，但存在标本不易获取的缺点，限制了其在临床上的广泛应用[2]。另有学者通过检测外周血标本分析XRCC3基因多态性，但外周血DNA获取主要源于白细胞，而非肿瘤细胞，影响了其检测的准确性[3]。循环肿瘤细胞(CTC)是肿瘤迁移和侵袭的主要机制；肿瘤细胞从病灶处脱落后进入外周血循环，部分定植于其他脏器，形成转移灶[4]。以CTC为标本的检测技术在较好地提供肿瘤细胞信息的同时，还便于多次、反复获取。本研究拟分别在肿瘤组织、外周血及CTC标本中检测NSCLC患者XRCC3基因多态性，以期探讨CTC能否替代肿瘤组织用于NSCLC患者XRCC3基因多态性分析。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2018年1月至12月于本院普外科就诊的中晚期NSCLC患者84例。其中男64例，女20例，年龄(57.3±8.3)岁；纳入标准：(1)经病理组织学检查确诊的原发性NSCLC患者，不伴有其他肿瘤史；(2)无化疗、生物疗法等抗肿瘤治疗史。TNM分期：Ⅲa期20例，Ⅲb期12例，Ⅳ期52例；病理分型：腺癌50例，鳞癌24例，腺磷癌10例。本研究经医院医学伦理学委员会批准(批准文号：2018-ZL03)，患者均知情同意。

1.2主要仪器及试剂 GS-20型负压抽吸系统(上海硅莱医疗器械公司)；Light Cycler 480型实时荧光定量PCR检测系统(瑞士Roche公司)；Olympus BX63型自动荧光显微镜(日本Olympus公司)；CelDocEZ型全自动免染凝胶成像分析系统(美国 Bio-Rad公司)。CTC免疫组化鉴定试剂盒(北京中杉生物技术公司)；FITC标记小鼠抗人CD45多克隆抗体(武汉友联特生物公司)；DAPI/细胞核染色试剂(上海碧云天生物公司)；EB染色试剂盒(重庆迈凯公司)；人染色体着丝粒特异性探针杂交混合液(上海起发实验试剂公司)；Trizol试剂(北京柏莱斯特科技公司)；BstEⅡ限制性内切酶(上海连桥生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 术中或病理检查时收集患者肺癌组织标本约2 g用于总RNA抽提，采用Trizol试剂提取组织RNA，变性梯度凝胶电泳检测RNA的浓度和纯度，取浓度>20 ng/μL、纯度>2.0的样本用于后续试验，置于-80 ℃保存。此外，收集化疗前患者清晨空腹外周静脉血3 mL，EDTA-K2抗凝，置于4 ℃保存。

1.3.2CTC富集、鉴定与荧光原位杂交 取患者经EDTA-K2抗凝的外周静脉血2 mL，经1%多聚甲醛在室温下预固定10 min，使用负压抽吸系统过滤外周血，PBS洗涤过滤得到的残余血液，4%多聚甲醛再次固定，将富集细胞的滤膜37 ℃烘干，根据CellSearch®标准[CK8/18/19+，含有细胞核的CD45-细胞(DAPI+)[5]]对CTC进行免疫组织化学染色鉴定。使用甲醇和冰乙酸混合液(3∶1)透化处理膜上细胞，加入30 μL人染色体着丝粒特异性探针杂交混合液，与滤膜上的细胞充分接触，置于杂交仪(76 ℃变性)中37 ℃温育12 h，次日洗膜除去探针杂交液，20 g/L胎牛血清封闭30 min，滴加5 μL FITC标记小鼠抗人CD45多克隆抗体(1∶500稀释)，4 ℃避光静置2 h，加入30 μL DAPI染料，4 ℃静置2 h。置于Olympus BX63型自动荧光显微镜下随机选取20个视野，计数CTC(呈亮蓝色和橘红色)的细胞数目。

1.3.3XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点基因型分析 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法分析XRCC3基因型。根据GenBank中XRCC3基因Thr241Met位点(C/T，rs861539)的序列号(AY181026)，由上海捷瑞生物公司采用Oligo7引物设计软件设计并合成引物。上游引物序列：5′-CCTTGCTCTGTCCCCTCTGT-3′，下游引物序列：5′-AGTCCCCACCCTCTTGTTCA-3′，退火温度57 ℃，产物片段大小630 bp。PCR反应总体积为30 μL，包括10×PCR Buffer 10 μL、dNTP mix 3 μL、10 μmol/L上、下游引物各1 μL、耐热DNA聚合酶2 μL、DNA模板1 μL、双蒸馏水12 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μL扩增产物经BstEⅡ限制性内切酶37 ℃酶切40 min，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳并进行EB染色，采用CelDocEZ型全自动免染凝胶成像分析系统检测并观察电泳结果，根据酶切后各片段大小确定XRCC3单核苷酸多态性和基因型。结果判读：XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点BstEⅡ限制性内切酶酶切后出现481 bp、265 bp、193 bp 3条条带，其中突变纯合型为481 bp，杂合型为481 bp、265 bp、193 bp，野生纯合型为265 bp、193 bp。

1.4统计学分析 采用SPSS 19. 0统计学软件进行数据处理，计数资料使用百分比表示，率的比较采用χ2检验及Fisher确切概率法；α=0.05为检验水准，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点检测结果 采用PCR-RFLP法可检出突变纯合型、杂合型及野生纯合型3种基因型，各基因型分布情况符合遗传平衡定律(χ2=17.592，P=0.000)。见图1。

2.2不同临床病理参数的NSCLC患者CTC个数比较 CTC个数在不同性别、年龄、病理类型及临床分期的NSCLC患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1不同临床病理参数的NSCLC患者CTC个数比较[n(%)]

2.3不同标本XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点多态性的一致性分析 结果显示，肿瘤组织、CTC及外周血标本XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点多态性阳性率之间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。以肿瘤组织检测结果为金标准，CTC检测XRCC3基因Thr241Met(rs861539)基因型与肿瘤组织基因位点多态性的一致率为95.24%(80/84)；外周血标本与肿瘤组织基因位点多态性的一致率为76.19%(64/84)。CTC检测基因位点多态性的一致率明显高于外周血标本，差异有统计学意义(χ2=16.482，P=0.000)。

表2不同标本XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点多态性的阳性率比较[n(%)]

2.4XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点多态性与NSCLC患者临床病理参数的关系XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点多态性在不同年龄、病理类型及TNM分期的NSCLC患者之间的差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3不同临床病理参数NSCLC患者XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点多态性比较[n(%)]

3 讨论

人类XRCC3基因首先从中国仓鼠卵巢细胞突变体系中分离得到，其能够编码1个包含346个氨基酸残基的蛋白质，并作为一种关键的DNA损伤修复基因，参与DNA单链断裂和碱基损伤的修复[5-7]。相关研究显示，XRCC3基因多态性与膀胱癌、食管癌、胃癌等多种恶性肿瘤的发生风险有关[8-10]。亦有研究显示，XRCC3基因多态性可影响铂类、卡铂、奥沙利铂等铂类化疗药物敏感性及治疗预后效果[11]。本研究结果显示，XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点多态性在不同年龄、病理类型及TNM分期的NSCLC患者之间存在明显差异，提示XRCC3基因多态性与NSCLC患者年龄等临床病理参数明显相关。另有研究显示，XRCC3基因rs861534和rs8615302位点的多态性与乳腺癌的内分泌治疗风险和转移复发风险密切相关[11-13]；XRCC3基因Thr241Met多态性可能参与胃癌易感性[14]。结合本研究结果推测，XRCC3基因多态性在与NSCLC患者年龄等临床病理参数呈明显相关的同时，还可能与肺癌易感性、化疗耐药性等存在关联，但需进一步深入研究。

由于NSCLC患者外周血易于采集，创伤小，DNA提取难度较低，因此目前相关研究多集中于检测外周血XRCC3基因型[15]；但由于DNA主要来自于外周血中的白细胞，对检测准确性造成了不良影响[16]。CTC指进入人体外周血的肿瘤细胞，主要来源于原发性或转移性肿瘤病灶组织，基因组构成与肿瘤组织具有高度一致性[11]。目前研究认为，以肿瘤组织为标本检测得到的XRCC3基因多态性准确性最高，但获得难度较高[17]；因此，探究CTC检测肿瘤相关基因突变是否能够替代肿瘤组织具有重要意义。本研究以肿瘤组织检测的XRCC3基因多态性为金标准，并与CTC和外周血检测的XRCC3基因多态性进行比较分析，结果显示，肿瘤组织、CTC及外周血检测XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点多态性的阳性率之间差异无统计学意义；我们进一步以肿瘤组织检测的XRCC3基因多态性为金标准，并比较CTC与外周血检测结果的一致率，结果发现CTC检测XRCC3基因Thr241Met(rs861539)位点多态性的一致性高达95.24%，明显高于外周血标本的76.19%,提示CTC能够较好地反映出肺癌组织基因型。目前临床上还可直接从外周血中分离和富集CTC，准确性高，无需通过手术获取肿瘤组织标本。但亦有研究显示，由于目前的CTC捕捉技术无法保证百分百的纯度，临床应用中需对捕获的细胞进行鉴定，以确定为CTC细胞，进而减少检测的假阳性率和假阴性率[18]；此外，在肿瘤的发生与发展过程中，CTC的数目呈动态变化的同时，其携带的分子标志物也在不断变化[19]。因此，临床应用CTC检测NSCLC患者基因型时应综合考虑以上因素，提高检测的准确性。虽然本研究纳入的患者均无化疗、生物疗法等抗肿瘤治疗史，避免了化疗等因素对XRCC3基因型的影响，但因此所纳入的样本量偏少，在今后的研究中应进一步扩大样本量进行深入研究。