LC-MS/MS技术检测新生儿干血斑甲基丙二酸、同型半胱氨酸cut-off值的建立

王彦云，孙云，张志蕾，程威，蒋涛(南京医科大学附属妇产医院&南京市妇幼保健院新生儿筛查中心，南京 210004)

甲基丙二酸血症(methylmalonic aciduria)是我国最常见的有机酸尿症，发病年龄各异，临床表现复杂多样，且缺乏特异性，易漏诊或误诊，死亡率和致残率很高，故而早诊断、早治疗显得尤为重要，目前已被列入欧美国家的首要筛查病种。二阶筛查(second-tier test)理论的提出将新生儿遗传代谢病筛查的模式从“初次筛查+召回复查”进化为“初次筛查-二阶筛查”。2014年，由来自美国和12个欧洲国家的25位专家共同制定了甲基丙二酸血症诊疗指南[1]，明确指出串联质谱(tandem mass spectrometry，MS/MS)检测丙酰基肉碱(propionylcarnitine，C3)等相关指标均缺乏疾病特异性，推荐对于MS/MS初次筛查阳性的样本采用高效液相色谱质谱-串联质谱联合检测(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技术进行二阶筛查。2016年底，我中心正式将LC-MS/MS技术应用于二阶筛查，可以一次实验同时定量检测干血斑中甲基丙二酸(methylmalonic acid，MMA)和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的浓度，虽然LC-MS/MS检测有规范化的流程可参考[2-3]，但是其检测结果的cut-off值尚未规范统一，目前许多实验室、科研机构使用的cut-off值为梅奥诊所提供[3]。然而，不同实验室的实际外部条件存在一定的差异，且不同种族、不同地域人群的各种代谢物水平之间亦存在差异。因此，每个实验室在新技术推广前，应根据其各自的检测条件建立相应的cut-off值。本研究通过前期的数据积累，采用ROC曲线确定了本实验室使用LC-MS/MS技术检测干血斑中MMA和Hcy的cut-off值，以期为各家筛查实验室提供实验依据。

1 材料与方法

1.1标本 收集2016年1月至2018年8月在我院进行MS/MS筛查的丙酰基肉碱(propionylcarnitine，C3)、乙酰基肉碱(acetylcarnitine，C2)和游离肉碱(free carnitine，C0)3个指标中有1个及以上指标偏高的新生儿初筛干血斑样本1 015例。另收集同期确诊为甲基丙二酸合并同型半胱氨酸血症的新生儿初筛干血斑样本16例。本研究通过南京医科大学附属妇产医院医学伦理委员会审核批准(宁妇伦字[2016]107号)，所有研究对象均知情同意。

1.2主要仪器与试剂 MS/MS检测系统(美国沃特世公司),Agilent 7890A-5975C GC/MS联用仪(美国安捷伦公司),20ADXR高效液相色谱仪(日本岛津公司),phenomenex Kinetex 2.6μ XB-C18 100A色谱柱(美国菲罗门公司),ADVIA 2400全自动生化分析仪(德国西门子公司),P800全自动生化分析仪及Hcy测定试剂盒(美国Roche公司)。MS/MS检测试剂盒(美国珀金埃尔默公司)，有机酸(气质法)测定试剂盒(浙江博圣公司)，甲醇、甲酸(美国西格玛公司)。

1.3MS/MS检测干血斑中C3及其比值的浓度 根据参考文献[4],采用非衍生化MS/MS技术,按照MS/MS检测系统及MS/MS检测试剂盒说明书操作检测干血斑中C3并计算C3/C2、C3/C0比值。C3参考范围：<3.5 μmol/L；C3/C2参考范围：<0.2；C3/C0参考范围：<0.18。

1.4气相色谱-质谱(GC-MS)检测 根据参考文献[4],采用非衍生化GC-MS技术,按照Agilent 7890A-5975C GC/MS联用仪及有机酸(气质法)检测试剂盒说明书操作检测甲基丙二酸血症患儿随机尿滤纸片样本中的MMA,MMA参考范围：0～3.5 μmol/L。

1.5循环酶法检测血清Hcy浓度 按照P800全自动生化分析仪及Hcy测定试剂盒(循环酶法)说明书操作检测甲基丙二酸血症患儿血清Hcy浓度。Hcy参考范围：3～50 μmol/L，超出范围样品稀释后复测。

1.6LC-MS/MS检测干血斑样本中MMA、Hcy浓度 根据参考文献[4],采用LC-MS/MS技术,按照MS/MS检测系统及本实验室自制试剂检测干血斑样本中MMA、Hcy浓度。根据梅奥诊所提供的LC-MS/MS技术检测干血斑中MMA和Hcy的cut-off值(分别以5.0 μmol/L和15 μmol/L)进行结果判读。

1.7MMA生化诊断标准[1,5]尿液MMA显著升高，血液C3升高或C3/C0、C3/C2升高，Hcy升高的患者，诊断为甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症；尿液MMA显著升高，血液C3升高或C3/C0、C3/C2升高，Hcy正常的患者，诊断为单纯型甲基丙二酸血症。

1.8统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行。用频数分布直方图观察MMA和Hcy在干血斑中的分布特征。正态分布计量资料采用t检验，偏态分布采用Mann-WhitneyU检验。偏态分布的计量资料用百分位数法确定MMA和Hcy在正常新生儿干血斑样本中的第0.5～99.5百分位界值。结合正常新生儿和甲基丙二酸血症患儿的检测数据，应用ROC曲线分析确定MMA和Hcy在干血斑中的cut-off值。

2 结果

2.1初筛干血斑样本中MMA和Hcy的浓度 1 015例阴性样本中MMA和Hcy呈偏态分布，其中MMA浓度分布区间为0～5.9 μmol/L，其99.5百分位界值为3.796 μmol/L；Hcy浓度分布区间为0.3～28.3 μmol/L，其99.5百分位点对应的数值为9.498 μmol/L。

2.2确诊甲基丙二酸血症患儿初筛干血斑中LC-MS/MS检测结果 本实验室确诊16例甲基丙二酸血症患儿，其初筛干血斑样本中LC-MS/MS的检测结果见表1。

表116例确诊甲基丙二酸血症患儿初筛干血斑中LC-MS/MS检测结果

2.3干血斑标本中MMA、Hcy浓度结果 采用Mann-WhitneyU检验比较正常新生儿和甲基丙二酸血症患儿两组参数，结果发现，甲基丙二酸血症患儿的MMA和Hcy浓度明显高于阴性样本，差异具有统计学意义(UMMA=8.5，UHcy=23.5，P均<0.05)。

2.4ROC曲线分析MMA及Hcy结果 针对1 015例阴性样本及16例阳性样本，以16例阳性标本作为实验组，1 015例阴性样本作为对照组，用ROC曲线分析其筛查甲基丙二酸血症的临床效能，结果发现MMA筛查甲基丙二酸血症的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.999，当cut-off值为3.145 μmol/L时，其敏感性为100%，特异性为99.5%。此外，以1 015例非甲基丙二酸血症患儿作为对照组，16例甲基丙二酸血症患儿作为实验组，ROC曲线分析Hcy筛查甲基丙二酸血症的临床效能，结果表明，其AUCROC为0.999，当cut-off值为7.295 μmol/L时，其敏感性为100%，特异性为99.3%。

2.5与梅奥诊所的cut-off值对比结果 本研究中南京地区人群的MMA和Hcy cut-off值明显低于梅奥诊所提供的cut-off值。结果见表2。

表2本实验室MMA和Hcy检测cut-off值与梅奥诊所对比结果(μmol/L)

3 讨论

我国新生儿遗传代谢病筛查开始于上世纪八十年代，由于MS/MS技术的应用极大地拓宽了筛查病种，提高了筛查效率。串联质谱已经发展成为遗传代谢病筛查中最理想的分析技术。甲基丙二酸血症作为我国最常见有机酸尿症[7]，是首要筛查的遗传代谢病之一，其在南京地区的发病率约为1∶11 000，全国的发病率暂无确切的统计数据。

长期以来，甲基丙二酸血症的早期发现主要依赖基于MS/MS技术的新生儿筛查，筛查指标为C3、C2、C0水平及其比值。采用的是基于MS/MS技术的“初次筛查+召回复查”模式。二阶筛查技术是在初次筛查技术上发展起来的准确性更高的一种筛查技术，是在原血片基础上检测目标疾病的生化诊断指标而不是筛查指标，以提高目标疾病检出率，降低假阳性率和避免漏筛。2004年，针对新生儿遗传代谢病筛查首次提出了“二阶筛查”的概念[8]。2007年，意大利学者开始尝试应用LC-MS/MS技术定量分析干血滤纸片中甲基丙二酸血症等遗传代谢病的特异性诊断指标以进行二阶筛查[9]，包括MMA、甲基枸橼酸、3-羟基丙酸、异戊酸、乙基丙二酸等。该研究结果表明，对甲基丙二酸血症MS/MS初次筛查阳性样本进行原血片二阶筛查，使阳性预测值从5.2%提高至20%。2010年，美国梅奥诊所Turgeon等[3]对LC-MS/MS技术进一步优化，使每个样本检测时间仅需要3 min，并通过200份阳性样本的研究，初步制定了LC-MS/MS技术检测干血滤纸片中MMA、Hcy等相关特异性指标的cut-off值。以上研究均表明，基于LC-MS/MS的二阶筛查技术具有更高的临床应用价值。然而，且前国内开展二阶筛查的研究报道较少。

新技术可以引进，但是cut-off值不能照搬。不同地域、不同人群的指标浓度可能存在差异，因此实验室在开展新项目时必须制定本实验室的参考范围或cut-off值。传统新生儿筛查检测项目，如促甲状腺素、苯丙氨酸、17α羟孕酮等，多选取数据分布的第0.5和99.5百分位界值作为上、下参考限的取值[10-11]。ROC曲线法是能够全面并准确评价诊断试验的有效工具，且能确定检测的最佳阈值。但是截止到目前，国内对于二阶筛查的报道非常少，更无二阶筛查指标cut-off值建立的研究和文献。本研究发现，MMA和Hcy两指标的99.5百分位界值与ROC曲线分析得到的cut-off值不一致，且99.5百分位界值均大于ROC曲线制定的cut-off值，鉴于甲基丙二酸血症一旦漏筛后果严重，筛查要求尽量避免漏筛，我们认为以ROC曲线制定的cut-off值作为召回患儿的标准更为可靠。但是，当新生儿该指标超过cut-off值时，不能立即诊断为异常，仍然需要考虑召回复查并进一步加以明确。

此外，与美国梅奥诊断提出MMA的cut-off值为5.0 μmol/L相比，南京地区人群MMA的cut-off值(MMA：3.145 μmol/L)远远低于国外的人群，进行数据比较后的结果进一步说明二阶筛查新技术引进后不能盲目的直接借调参考值或cut-off值，新技术引进后必须尽快确定适应于当地人群和该实验室的cut-off值。

必须指出，足够的阳性样本量是如实反应试验准确性、排除机会干扰的保证，因此ROC曲线在实际应用中要求有一定数量的阳性样本，最好阳性样本量能大于30例。本中心开展LC-MS/MS检测时间尚短，积累的阳性样本量有限，随着后续更多阳性样本的积累和纳入，该cut-off值可以继续利用ROC曲线进一步调整。此外，本研究目的仅仅是在于给其他筛查中心制定该实验室的cut-off值提供一种可靠的方法，而不是推广本研究中的参考范围。