不同程度慢性阻塞性肺病患者外周血单个核细胞p38MAPK、NOD2及ROCK1表达及与肺动脉高压、炎症进展的相关性

程清，徐艳，邓心悦，陈国飞(苏州市中西医结合医院检验科，苏州215000)

慢性阻塞性肺病(COPD)是慢性气道炎症导致的慢性气道阻塞性肺疾病的统称，可并发肺动脉高压，严重者可导致肺源性心脏病。研究表明，多数肺心病患者是由COPD导致的[1]。COPD发病机制复杂，炎性介质、炎性细胞、固有免疫等因素与疾病的发展关系密切[2]。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)作为应激蛋白激酶，是细胞中重要的信号传递者，参与了应激和炎症反应的调控[3]。核苷酸结合寡聚化结构域2(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing family receptors 1,NOD2)在机体固有免疫中发挥重要作用，有学者指出，NOD2可激活核因子κB(NF-κB)，进而启动炎性反应进程[4]。Rho激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK)与血管重构、血管内皮增生关系密切，其参与了肺动脉高压、肺心病等过程[5]。因此，通过对COPD患者外周血单个核细胞p38MAPK、NOD2及ROCK1表达水平的检测，可了解相关COPD发展机制，阻断或抑制有关炎性因子和炎症细胞活化的关键靶点，进而阻断COPD的进展，可能为COPD的治疗提供新思路。本研究对COPD患者外周血单个核细胞p38MAPK、NOD2及ROCK1的表达水平进行了分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取我院2017年10月至2019年10月收治的急性发作期COPD患者(AECOPD)60例作为AECOPD组，男35例，女25例，年龄(68.7±3.9)岁；60例COPD稳定期患者作为COPD组，男37例，女23例，年龄(67.5±4.3)岁；纳入标准：(1)均符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版》的诊断标准[6]，并经临床及影像学检查确诊；(2)能够配合完成肺功能检查；(3)均自愿参与本研究并签署知情同意书。排除标准：(1)合并支气管扩张、肺纤维化、支气管哮喘等肺部疾病者；(2)肝、肾、心等脏器功能障碍者；(3)近期接受糖皮质激素等药物治疗者；(4)合并血液系统、免疫系统、神经系统疾病及恶性肿瘤患者。根据肺功能分级将COPD稳定期患者分为低危组(肺功能分级为Ⅰ～Ⅱ级，n=36)和高危组(肺功能分级为Ⅲ～Ⅳ级，n=24)，低危组中男22例，女14例，年龄(67.4±4.4)岁；高危组中男15例，女9例，年龄(67.7±4.1)岁；另选择体检健康者60例作为健康人对照组，男34例，女26例，年龄(68.1±4.5)岁，均肺功能正常，无呼吸系统疾病。各组研究对象性别、年龄比较差异无统计学意义(χ2=0.333，P=0.954；F=1.334，P=0.185)，具有可比性。

1.2主要仪器及试剂 Min-Proten Tetra System电泳仪、荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，MasterScreen肺功能仪(德国耶格公司)，Benchmark酶联仪(德国Benchmark公司)，CytoFLEX流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-18、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)试剂盒(美国D&G公司)，RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，p38MAR、NOD2、GAPD引物序列(上海生工公司)，人淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)，磷酸缓冲液(美国Gibco公司)。

1.3肺动脉平均压及肺功能测定 所有研究对象均于呼吸内科行肺动脉平均压和肺功能测定，肺功能测定采用MasterScreen肺功能仪测定第1秒用力呼气容积(FEV1)、FEV1 占预计值百分比(FEV1%)及用力肺活量(FVC)指标。

1.4血清炎症因子测定 所有研究对象均清晨抽取空腹静脉血5 mL，3 000 r/min离心15 min分离血清，置于-80 ℃保存，并于当日完成各项检测。采用ELISA法测定IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α、CRP的表达水平。采用Benchmark酶联仪于450 nm波长下测定吸光度(A)值，以上均严格依照仪器及试剂盒说明书操作。

1.5外周血单个核细胞(PBMC)分离 另取各研究对象的空腹静脉血5 mL，EDTA-K2抗凝，加入5 mL PBS稀释，室温下将4 mL淋巴细胞分离液和10 mL稀释后的空腹静脉血加入至15 mL离心管中，2 000 r/min离心20 min。小心吸取第2层单个核细胞，并转移至10 mL离心管中，PBS洗涤，1 000 r/min离心10 min，弃上清。PBS重复洗涤1次，取沉淀的单个核细胞，经0.4%台盼蓝染色，收集外周单个核细胞(活细胞>90%)用于后续实验。

1.6荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测p38MAPK、NOD2mRNA的表达 采用Trizol试剂提取上述各组单个核细胞的总RNA，取吸光度(A260/280 nm)比值在1.8～2.0的样本，置于-80 ℃保存。按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书操作将RNA逆转录为cDNA，置于-20 ℃保存。参照文献[7-8]，根据GenBank中p38MAPK、NOD2基因的序列号(NM-001315、NM-022162)，用Primer Premier 5.0软件设计引物，并送上海生工公司合成。其中p38MAPK上游引物序列：5′-AAGTTCCTGTCCACATT

GCC-3′，下游引物序列5′-TGGATTCAGTGTCAAGCT

GC-3′；NOD2上游引物序列5′-CACCCTGACCGTGT

CCTGT-3′，下游引物序列5′-CACCTTGCGGGCATTC

TT-3′；GAPDH上游引物序列5′-TCAACAGCGACAC

CCACTCC-3′，下游引物序列5′-TGAGGTCCACCACC

CTGTTG-3′。PCR总反应体系为25 μL，包括：10 μmol/L上、下游引物各1 μL，dNTPs 4 μL，10×PCR buffer 1 μL，模板DNA 2 μL，无菌ddH2O补足体积至25 μL。循环参数：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。采用荧光定量PCR仪配套的CFX96系统软件于55～95 ℃时收集荧光，并进行熔解曲线分析。结果以2-△△Ct法计算。

1.7流式细胞术检测单个核细胞中ROCK1的表达 取上述分离的单个核细胞，PBS洗涤2次，加入500 μL PBS重悬，加入10 μL FITC-ROCK1或同型对照，室温温育30 min，使用CytoFLEX流式细胞仪检测10 000个单个核细胞，并采用配套的数据获取和分析软件CytExpert计算ROCK1的表达水平。

1.8统计学分析 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均值±标准差表示， 3组及以上数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；各指标相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组肺动脉平均压和肺功能比较结果 AECOPD组肺动脉平均压显著高于低危组、高危组和健康人对照组，而FEV1、FEV1%及FVC显著低于低危组、高危组和健康人对照组(P均<0.05)。随着COPD患者病情程度加重，低危组、高危组、AECOPD组患者肺动脉高压逐渐升高，而FEV1、FEV1%及FVC逐渐降低，差异均具有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1各组肺动脉平均压和肺功能比较

2.2各组血清炎症因子水平比较 AECOPD组血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α及CRP均显著高于高危组、低危组和健康人对照组，且随着COPD患者病情加重，血清中各炎症因子的表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2各组血清炎症因子表达水平比较

2.3各组外周血单个核细胞p38MAPK、NOD2mRNA及ROCK1的表达水平比较 RT-PCR检测p38MAPK、NOD2mRNA及流式细胞术检测单个核细胞中ROCK1的表达结果表明，与健康人对照组比较，低危组、高危组及AECOPD组p38MAPK、NOD2mRNA及ROCK1的表达水平均显著升高(P均<0.05)。见表3。

表3各组外周血单个核细胞p38MAPK、NOD2 mRNA及ROCK1的表达比较

2.4急性发作期COPD患者p38MAPK、NOD2mRNA及ROCK1表达与各指标的相关性分析 Peasson相关性分析结果显示，急性期COPD患者p38MAPK、NOD2mRNA及ROCK1的表达水平与FEV1、FEV1%、FVC呈负相关，而与肺动脉平均压、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α及CRP呈正相关(P<0.05)。见表4。

3 讨论

本研究结果显示，COPD患者自低危组、高危组至AECOPD组病情逐渐加重，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α及CRP水平均明显升高，提示患者机体处于慢性炎症进展状态，并随着病情加重，患者肺功能平均压逐渐升高，肺功能明显降低。IL-1β可激活巨噬细胞等炎症细胞促进炎症介质释放，造成肺部粒细胞、巨噬细胞炎症浸润。CRP作为经典炎症标志物，可反应COPD患者机体炎症反应、组织损伤程度，在COPD炎性反应扩大过程中发挥重要作用。IL-6、IL-8均可加重气道炎症反应。IL-17可调节肺巨噬细胞、气道中性粒细胞激活和趋化，在COPD发病与发展过程中具有重要作用[9]。以上研究表明，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α及CRP均可作为COPD疾病相关的炎症指示因子。

表4p38MAPK、NOD2 mRNA及ROCK1表达与各指标的相关性分析

本研究还发现，在COPD患者中p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1的表达水平均显著升高，且在AECOPD患者中的表达水平更高。提示p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1表达与COPD疾病进展存在密切关系。有学者指出，p38MAPK在COPD患者尤其是急性期患者的肺泡巨噬细胞中的表达水平明显升高，p38MAPK反映了COPD肺部慢性炎症发展水平，并可作为COPD治疗的潜在新靶点[10]。另有研究证实，p38MAPK抑制剂可减少IL-8、TNF-α等炎症介质的释放[11]。因此，p38MAPK为炎症因子释放和炎性细胞活化的重要靶点，在COPD发展的炎症机制中具有重要作用。有学者还发现，COPD患者受感染、吸烟等刺激可导致NOD2的表达水平升高，引发炎性反应，从而导致病情加重[12]。NOD2可通过NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路产生IL-6、IL-1β等炎症因子，造成COPD病情不稳或急性发作。本研究中，急性期COPD患者p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1与肺功能指标呈负相关，与肺动脉平均压、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α及CRP呈正相关，提示p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1参与了COPD患者急性进展过程，并影响了患者肺动脉压和肺功能。因此，p38MAPK、NOD2、ROCK信号通路可能参与了COPD气道重塑、慢性炎症反应、局部缺氧损伤等多个病理、生理过程。COPD患者慢性炎症导致间质慢性炎性细胞浸润，进而导致p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1的表达水平升高。但本研究纳入的样本量较小，导致结果可能存在一定程度的偏差；此外，本研究并未深入探究p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1影响COPD患者炎症进展的具体分子机制，需进一步扩大研究对象并深入分析。综上所述，p38MAPKmRNA、NOD2mRNA及ROCK1参与了COPD患者炎症进展，并与患者肺功能高压、肺功能等病情严重程度存在密切关系。