肿瘤靶向治疗新抗原筛选与临床研究进展

费宇翔,赵杨静，王荟，邵启祥(江苏大学医学院.临床医学系，b.检验系，免疫学与免疫学检验教研室，c.基础医学研究所，江苏镇江 212013)

近十余年来，肿瘤免疫治疗取得了重大进展，免疫检查点抑制剂[1]、治疗性肿瘤疫苗[2]和以嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)[3]为代表的过继性细胞免疫治疗在临床上开展的如火如荼。尽管这些免疫治疗在血液系统肿瘤、肺癌等治疗中收到了较好的临床效果，但因缺乏特异性肿瘤抗原以及肿瘤存在多种免疫逃逸机制，许多肿瘤的免疫治疗仍然举步维艰[4]。

肿瘤抗原作为免疫系统识别癌细胞的靶点，是抗肿瘤免疫应答的起点，在过继性细胞免疫治疗和肿瘤疫苗的研发中占据核心地位。根据抗原的特异性，肿瘤抗原可分为肿瘤相关抗原(tumor associated antigens，TAA)和肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen，TSA)。大量研究表明，TAA的免疫特异性差，且由于多数TAA属于胚胎抗原，在个体发育过程中已诱导机体的免疫耐受，不仅免疫原性弱，而且很难诱导出持久特异性免疫应答。此外，靶向TAA的治疗后，可能打破机体的免疫耐受，导致活化的免疫细胞攻击表达TAA的自身正常组织，从而引发自身免疫应答和自身免疫病。TSA是体细胞基因由于理化、环境等因素诱发或自发突变诱导，经非同义点突变、插入缺失、基因融合和移码突变等方式产生的肿瘤新抗原(neoantigen)。长期以来，由于肿瘤新抗原往往只有1个或数个氨基酸的改变，所以很难被发现；目前常用的血清学筛选重组cDNA表达文库(serological analysis of recombinant cDNA expression library，SEREX)和基于HLA结合肽的鉴定等筛选方法，因工作量大、耗时长，海量的数据背后存在大量的无效数据，故而效率极其低下；第一代测序方法代价大，耗时长，难以开展深度测序，很难发现和鉴定少量的基因突变。近年来，随着二代测序(next-generation sequencing，NGS)等技术的研发，深度测序、单细胞测序技术蓬勃发展，全球肿瘤基因组计划的实施和癌症基因组图集(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的完成，为高效准确地对患者个性化测序、筛选、确定和制备肿瘤新抗原创造了有利条件[5]。相对于TAA，肿瘤新抗原具有在肿瘤组织中特异性表达、免疫原性强、与主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)亲和力高等优势。研究发现，当免疫检查点抑制剂阻断肿瘤微环境中的抑制性信号后，肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)对肿瘤新抗原能发挥有效地杀伤作用，促进免疫检查点抑制剂的疗效，在多种肿瘤的免疫治疗中取得突破性进展[6]。由此可见，肿瘤新抗原的筛选对肿瘤免疫治疗具有重要意义，本文围绕肿瘤新抗原的筛选方法、基于肿瘤新抗原的免疫治疗及临床应用研究进展进行综述。

1 新抗原的筛选方法

由于患者肿瘤细胞的DNA突变、新抗原谱和MHC分子的多样性和异质性，个体化新抗原筛选是靶向新抗原治疗方案中关键的第一步，决定了抗原是否能被抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)提呈、被TCR识别和最后的治疗的效果、成本和时间。用于筛选获取新抗原的个体或突变体细胞应满足4个条件：(1)突变基因在蛋白质水平有表达；(2)突变蛋白可被APC加工成适合于自身MHCⅠ提呈的多肽；(3)突变肽与患者自身MHCⅠ分子具有高亲和力；(4)抗原肽—MHCⅠ复合物与效应T细胞受体(T cell receptor，TCR)具有高亲和力[7-8]。目前常用于肿瘤新抗原筛选的方法主要有外显子组结合转录组测序法、串联微基因序列法、靶基因测序法、共享新抗原肽库法、抗原配体组学和质谱联合技术等。

1.1外显子组结合转录组测序法 cDNA文库是筛选肿瘤新抗原的经典方法，但由于其耗时长、通量低等缺点，逐渐被二代测序技术取代。Yadav等[9]和Sahin等[10]分别在动物实验和恶性黑色素患者中采用外显子组测序(whole-exome sequencing，WES)和转录组测序法联合筛选获得了有效的新抗原肽。该方法主要包括以下步骤：首先对肿瘤组织和配对癌旁组织进行全外显子组测序，然后对测序结果进行DNA比对，筛选出肿瘤特异性突变，再利用转录组测序验证突变位点；在此基础上，对肿瘤患者外周血细胞进行HLA基因分型，通过NetMHCpan等生物信息学软件预测候选突变位点抗原肽与HLA-Ⅰ亲和力，筛选出亲和力最高的抗原肽；最后合成抗原肽，在体外验证新抗原免疫原性，将负载了新抗原的APC与患者的T细胞体外共培养，检测T细胞活化标志物以验证筛选获得的新抗原能否有效活化T细胞免疫应答。

1.2串联微基因(tandem minigenes，TMGs)序列法 TMGs与外显子组结合转录组测序法相似，但更为简便。该方法是在基因测序与MHC分型之后，直接合成由多个含有突变位点的微基因组成的串联微基因序列，这些微基因序列编码了12～13个氨基酸的突变肽，再从体外转录为RNA以验证免疫原性[11]。该方法已在上皮癌、黑色素瘤和胃肠道肿瘤等肿瘤新抗原筛选上成功应用，并获得了很好的结果。

1.3靶基因测序法 Chen等[11]在评估上述方法优缺点的基础上，建立了对肿瘤基因序列、循环肿瘤DNA和正常组织的临床级靶向测序法，找出非同义体细胞突变的靶基因，并在晚期难治实体瘤临床试验中取得了良好的效果。通过计算机分析、HLA结合亲和力和突变等位基因频率综合评价候选突变抗原肽，缩小候选突变抗原肽范围。该方法主要采用以下条件筛选抗原肽：(1)半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)以小于50 nmol/L的解离常数或亲和力百分比小于50%筛选与HLA强结合肽；(2)具有较高的肿瘤突变等位基因频率；(3)预测可结合2种及以上HLA分子；(4)通过多种算法预测出的多肽。体外抗原刺激T细胞的方式和时间是影响免疫应答的关键因素，体外鉴定新抗原的有效应答主要基于记忆T细胞应答，如果用树突状细胞(dendritic cell，DC)等APC负载新抗原刺激从患者分离的T细胞产生快速应答，则说明机体对该肿瘤抗原已产生特异性的有效初次应答，同时也说明该新抗原在体内加工提呈识别途径是完整的[12]。该团队运用此方法筛选出的新抗原在75%的患者中可被自体T细胞识别，并诱导强烈的免疫应答。

1.4共享新抗原肽库法 Chen等[11]建立了1个包含多种高频突变基因的可共享新抗原肽库，若患者检测到的热点突变和HLA等位基因与肽库中匹配，可直接进行新抗原鉴定。该团队首先在TCGA和癌症的体细胞突变的目录(catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC)数据库中筛选出21个在9种人类恶性实体瘤中高频突变基因，再从癌症驱动基因KRAS、TP53、CTNNB1、EGFR、BRAF、PIK3CA和GNAS中筛选出了29个理想的候选热点突变构建共享新抗原肽库，这些突变覆盖了9种实体瘤中9%～90%的患者，最后合成经算法检验优先级别高的新抗原肽用于临床验证。

1.5抗原配体组学和质谱联合技术 该技术主要是基于HLA-Ⅰ/Ⅱ结合抗原肽，并提呈给T细胞识别的原理，构建HLA-Ⅰ/Ⅱ结合肽库，通过MS进行鉴别。同时对肿瘤来源的组织进行外显子测序，确定突变的基因，把两种结果进行重合分析，筛选出候选肽。Bassani-Sternberg等[13]利用质谱技术在25例黑色素瘤患者中检测到与肿瘤高度相关的HLA-Ⅰ/Ⅱ结合抗原肽，发现了大量TAA，并在11个体细胞突变肽段中筛选到了4条具有良好免疫原性的肽段，同时在患者肿瘤和外周血中也检测到其特异性T细胞。Bulik-Sullivan等[14]基于质谱数据，建立了具有较高特异性和深度学习功能的HLA预测算法的EDGE模型，其不依赖MHC多聚体，只需要有限的外周血筛选少量抗原肽数据进行训练。由于不同肿瘤非同义突变后产生新抗原的概率是不同的，一般而言，肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)在>1～10个突变/MB的患者可以产生新抗原，而这个负荷相当于1个肿瘤基因中出现15～150个非同义突变。95%突变为点突变基因，而点突变引起的蛋白质空间构象改变很小，常不能成为优势抗原，只有插入、删除或移码突变的因氨基酸改变较大，产生空间构象改变明显，从而有可能成为抗原，真正能与MHC分子具有高亲和力的同时又能被患者TCR所识别的抗原仅占其中约1%，因此在10个突变/MB的突变负荷中，最多有1～2个新抗原。故而新肿瘤抗原的筛选具有工作量大，有效收获率低的特点。

目前临床应用免疫学治疗的患者多数是手术或放化疗后复发的、晚期难治性肿瘤患者，其生存时间较短；此外，多数肿瘤患者的突变存在个性化。规模大、耗时长的方法显然不适合临床应用。外显子组联合转录组测序法与串联微基因序列法筛选方法的优点是筛选范围大，不容易遗漏，但这也正是其缺点所在。由于筛选出的候选新抗原数量庞大，其存在能够引起有效免疫应答的新抗原少，低于液体活检测序深度和缺乏对实体瘤常见驱动突变新抗原的免疫原性评估等问题，且检测时间较长，易延误治疗，因此不适合晚期肿瘤新抗原的筛选。靶基因测序法筛选出的新抗原数目少，容易遗漏有效应答基因，但优点是大大减少了候选抗原肽的数目与鉴定时间，相对而言更适合临床应用。共享新抗原肽库主要筛选的是驱动突变产生的抗原，但是驱动突变产生新抗原的概率低，覆盖面比较窄，容易遗漏有效应答抗原。该肽库目前容量小，优先级较低，但是可以通过多中心共享拓展库容的方法弥补，其优点是可以直接获得抗原肽序列应用于临床。抗原配体组学联合质谱方法，虽然费用高，但筛选的候选肽数量大，能直接获得有效应答肽段，短期可以应用于临床。

综上所述，目前许多实验室将多种方法联合应用，很少独立采用一种方法。预计在不远的将来，随着大数据、人工智能深度学习等计算机科学的发展和完善，肿瘤新抗原的筛选将日益简化，实验室能够在短期内筛选出引发有效T细胞应答的新抗原，为肿瘤患者的临床治疗提供有力的武器和合适的靶标。

2 靶向新抗原免疫治疗的临床应用研究

目前利用新抗原临床免疫治疗的主要分为2个方面：一方面是应用于免疫检查点疗效预测和评估，另一方面应用于细胞免疫治疗，包括肿瘤疫苗、TCR-T和CAR-T等过继免疫治疗。

2.1新抗原负荷预测免疫检查点抑制剂疗效 大量的文献报道肿瘤突变负荷越高的患者，采用免疫检查点抑制剂PD-1/PDL-1抗体治疗的效果越好，这实际上反映了TMB越高，肿瘤突变产生能激发自身T细胞应答的新抗原的概率就越高，当通过PD-1/PD-L1去除免疫抑制后，机体免疫细胞能有效识别新抗原，从而杀伤肿瘤细胞。Rizvi等[15]对使用PD-1抗体pembrolizumab治疗的非小细胞肺癌患者进行全外显子组测序，发现获得持久性临床受益(局部或稳定反应时间大于6个月)的患者比获得非持久性临床受益的患者拥有更高的新抗原负荷(中位数为203 vs 83个月，P=0.001)，且新抗原负荷与无进展生存率的改善相关(中位数为14.5 vs 3.5个月，P=0.002)。反之，在使用免疫检查点抑制剂治疗非小细胞肺癌的患者时，发现肿瘤的耐药性与肿瘤特异性新抗原的突变丢失有关。因此，新抗原负荷可能是一个判断免疫检查点抑制剂治疗肿瘤疗效和预后的理想生物学标志物。

2.2肿瘤新抗原治疗性疫苗的临床应用 新抗原疫苗可促进患者体内新抗原特异性T细胞的增殖活化，增强免疫系统对肿瘤细胞的杀伤，也可避免传统肿瘤疫苗靶向TAA诱发的自身免疫应答。目前临床应用的新抗原疫苗主要包括DC疫苗、肽疫苗、RNA疫苗等，通过皮下或淋巴结内直接注入接种患者。DC疫苗是利用负载新抗原肽的DC直接将新抗原提呈给T细胞；肽疫苗接种后，可直接与体内DC细胞上相应的HLA结合，提呈给T细胞；RNA疫苗则通过接种编码新抗原肽的RNA片段，在体内被翻译成新抗原肽后再由HLA提呈。

Ott等[16]应用20种肿瘤新抗原的个体化疫苗在恶性黑色素瘤患者中进行Ⅰ期临床试验，结果发现这些新抗原疫苗分别可诱导 16%的CD8+T细胞和60%的CD4+T细胞应答，其进一步在6例病灶切除的晚期黑色素瘤患者中进行验证，结果发现在接受疫苗治疗后，其中4例患者无复发生存时间为25个月，2例复发患者在PD-1抗体治疗后肿瘤消退，新抗原特异性T细胞增多。

随着新抗原鉴定的方法不断发展和优化，靶向新抗原的肿瘤疫苗逐渐引起了学界的关注。在多项临床试验中，靶向个体化筛选新抗原的疫苗均取得了很好的疗效，且疫苗的安全性有所保证，治疗期间所产生的毒副作用也在预计之中。但总体来说，新抗原肿瘤疫苗的研发与临床应用仍处于起步阶段，临床大样本试验很少，对于不同肿瘤的疗效参差不齐；在不同的肿瘤中，使用不同类型的疫苗效果还缺乏很好的评估方法；肿瘤屏障的突破仍然是实体瘤治疗的瓶颈；克服肿瘤微环境的抑制还没有很好的破解办法。因此，肿瘤疫苗要取得突破性进展还有较长的路要走。

2.3靶向新抗原的过继性免疫细胞治疗

2.3.1新抗原特异性TIL细胞的过继治疗 Dudley等[17]最早应用TILs过继免疫治疗方法，从患者手术切除的肿瘤组织中分离浸润的T细胞，通过体外IL-2培养扩增后回输来发挥抗肿瘤效应。理论上，通过二代测序筛选的靶向肿瘤新抗原的TILs，相比单纯分离出的TILs可能会有更好的治疗效果。Zacharakis等[18]体外扩增可对4种突变蛋白(SLC3A2、KIAA0368、CADPS2和 CTSB)产生应答的TILs，再回输治疗，使1例晚期难治性转移性乳腺癌患者取得了超过22个月的完全持久性缓解，表明通过新抗原筛选的特异性应答TILs可有效杀伤肿瘤。另有学者发现，新抗原特异性应答TILs可有效提高肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂的敏感性，两者联合使用可获得很好的协同作用[19]。TILs体外培养扩增的技术较为成熟，若结合前文新抗原肽库等较为快速的新抗原筛选方法，可快速培养出新抗原应答性TILs，应用于临床治疗。

2.3.2T细胞受体工程T细胞 TCR-T是采用基因工程技术将克隆的特异性识别肿瘤抗原TCR移植到自体CD8+T细胞上，使其获得特异性杀伤肿瘤细胞的能力。当患者抗肿瘤免疫功能低下或微环境中肿瘤特异性TILs缺乏时，新抗原特异性TCR-T细胞疗法是一种具有优势的选择。Robbins等[20]使用TCR-T技术验证了靶向癌症—睾丸抗原(cancer testis antigen，CT)NY-ESO-1的TCR-T介导的抗肿瘤作用，结果发现45%的黑色素瘤患者及67%的滑膜肉瘤患者出现临床应答反应。

靶向gp100和NY-ESO-1等TAA的TCR-T取得了较好的疗效，但这些抗原在正常细胞上也有表达，导致TCR-T治疗过程中出现“脱靶”现象，在杀伤肿瘤细胞的同时也会破坏表达相同抗原的正常细胞。Morgan等[21]在采用TCR-T技术靶向MAGE-A3治疗黑色素瘤时，结果发现T细胞也识别在脑内表达的MAGE-A12，出现严重的神经毒副作用。靶向肿瘤特异性抗原的TCR-T细胞理论上可解决“脱靶”问题。Klebanoff等[22]采用外显子组和转录组测序技术鉴定肿瘤组织中的新抗原，与TILs共培养后筛选新抗原特异性T细胞，并克隆TCR序列导入新的T细胞，制备出新抗原特异性TCR-T细胞，目前尚在临床试验中，相信今后会取得较好的效果。

2.3.3嵌合抗原受体T细胞 CAR-T与TCR-T类似，其最大的优势是采用BCR的方式识别抗原，可识别通常不被TCR-T识别的碳水化合物和糖脂[23]，且无需通过抗原提呈过程，也不受MHC的限制，在一些MHC表达低下或不表达的肿瘤上也可发挥作用。

然而，CAR-T也会出现“脱靶”现象，在使用针对酪氨酸激酶受体2(V-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2，ErbB2)的CAR-T细胞治疗结肠癌患者时，患者肺部出现了大量CAR-T细胞，并导致细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)、多器官衰竭[24]。制备靶向肿瘤特异性新抗原的CAR-T有可解决“脱靶”问题，目前靶向ErbB2、神经节苷脂(disialoganglioside，GD2)、前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)新靶点的CAR-T的临床试验也正在进行[25]。

3 总结与展望

基于靶向新抗原的免疫治疗是一种个体化精准医疗方式，具有良好的应用前景，而新抗原筛选与鉴定是关键的第一步，提高新抗原筛选的速度与准确性可使更多晚期难治性肿瘤患者获益。新抗原免疫治疗和免疫检查点抑制剂联合应用有望获得更好的疗效。

目前靶向新抗原的免疫治疗仍面临许多挑战，MHC表达缺失等原因导致抗原表位无法提呈，使靶向原表位的T细胞无法发挥作用，靶向驱动突变(driver mutation)产生的新抗原相比于靶向过客突变(passenger mutation)有望降低突变表位无法提呈的情况；突变负荷较低的肿瘤无法寻找合适的新抗原和新抗原特异性T细胞等问题，很难在治疗中获益；此外，治疗有效的个体中还面临严重的自身免疫损伤和CRS带来的严重毒副作用，尚未找到很好的破解方式。目前多数的肿瘤新靶点筛选的方法和新靶点肿瘤特异性T细胞的临床应用还处于实验阶段，还需要进行相当长时间的临床探索；实体瘤的免疫治疗尚未取得突破性进展；即使有的免疫治疗最终获得良好效果，但动辄数十万甚至上百万的天价治疗费用，仍然让许多癌症患者不能受益，甚至因病致贫。因此如何获取高效、快速和廉价的肿瘤新抗原的筛选方法，有效的扩增抗原特异性T细胞，还有待于我们继续努力探索。

总之，靶向新抗原免疫治疗是目前最前沿、最具前景的肿瘤免疫治疗方向之一，大数据、人工智能深度学习等技术将助推肿瘤的免疫治疗，加快新抗原的筛选速度，提高筛选效率，有效降低成本。肿瘤的临床免疫治疗的道路布满荆棘，但前途是光明的，相信在不远的将来会取得新的突破。