ING4在结肠和直肠的胃肠间质瘤表达的研究

彭芳，钟斌，王建，张功亮，杨人泽

(1、赣州市人民医院病理科，江西赣州341000；2、赣南医学院第一附属医院药剂科，江西赣州341000)

ING4在结肠和直肠的胃肠间质瘤表达的研究

彭芳1，钟斌2，王建1，张功亮1，杨人泽2

(1、赣州市人民医院病理科，江西赣州341000；2、赣南医学院第一附属医院药剂科，江西赣州341000)

目的研究ING4与结肠和直肠的胃肠间质瘤的恶性程度的关系。方法收集原发于结肠和直肠的胃肠间质瘤共62例，并用RT-PCR方法和免疫组织化学方法检测ING4 mRNA和ING4蛋白在胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中的表达情况。结果RT-PCR技术测定胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING4与β-actin光密度比值平均值分别为0.32、0.51、0.56和0.78胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING4 mRNA的量也依次增加，差别有统计学意义（P＜0.05）。62例ING4免疫组织化学结果：高危组阳性3例（阳性率18.8%）；中危组阳性6例（阳性率26.1%）；低危组阳性10例（阳性率55.6%）；极低危组阳性3例（阳性率60%）。胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING4蛋白表达阳性率也依次增加，差别有统计学意义（P＜0.05）。结论ING4可以作为一个新的评价胃肠道间质肿瘤恶性程度的指标。

ING4；胃肠间质瘤；RT-PCR；免疫组织化学

ING4基因是Shiseki M等[1]于2003年发现肿瘤抑制基因，它参与调节P53活性、肿瘤血管的增生、细胞对缺氧状态的适应、细胞接触抑制的丢失以及细胞对化学药物敏感性等影响肿瘤的发生、生长及对肿瘤治疗的多个方面[1-6]。胃肠间质瘤是胃肠道常见的间叶源性肿瘤，可发生于胃肠道的任何部位，这种肿瘤起源于间质的起搏细胞（Cajal细胞）[7]，这些起搏细胞穿插在肠壁平滑肌组织和自主神经系统之间[4，8]。本实验在基因水平和蛋白水平探讨ING4与结肠和直肠的胃肠间质瘤的恶性程度的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集我院2005年至2016年10月间原发于结肠和直肠的胃肠间质瘤共62例。男性38例，女性24例，年龄31～79岁，平均年龄55岁。51例肿瘤位于结肠，11例肿瘤位于直肠。41例患者表现为反复发作腹痛，查体发现腹部包块，9例患者以消化道出血为首发症状就诊，4例以肿瘤破裂合并急腹症，8例患者体检发现肿块入院。肿瘤最大径0.5～12cm，平均最大径4cm。56例肿瘤边界尚清楚，6例肿瘤破裂。其中黏膜下3例，肌壁间32例，浆膜外27例。肿物切面实性，灰红色灰白色，部分区域呈鱼肉状，质中偏嫩，灶性区域囊性变伴出血坏死。根据肿瘤大小、核分裂像和有无肿瘤性坏死分为高危组、中危组、低危组和极低危组，其中高危组16例，中危组23例，低危组18例，极低危组5例。

1．2实验材料ING4和β-actin引物购自天为时代科技（北京）有限公司，2×Taq PCR MasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司，Trizol和Prime ScriptTMRT reagent kit购自宝生物工程（大连）有限公司。一抗兔抗人ING4多克隆抗体购自英国Abcom公司，兔鼠通用型免疫组化SP法检测试剂盒及DAB显色剂均购自福建迈新生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 RT－PCR方法总RNA提取：取约200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol匀浆。震荡30s。加0.2ml氯仿，剧烈地摇动30s，静置3min。12000×g，4℃离心，15min。吸出上层无色水相，移入另一个EP管中（约0.5ml）。加入等体积的异丙醇，混匀，静置10min。12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA的沉淀，弃去上清，加75%乙醇1ml，振荡。7500×g，4℃离心，10min。弃去上清，用滤纸吸取残留液体，室温下干燥5～10min。沉淀溶于20μl DEPC水中，-70℃保存。

1.3.2 计算总RNA提取样品的纯度与质量所有标本的OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.0之间，表明总RNA纯度较高，没有蛋白质残留。总RNA变性琼脂糖凝胶电泳结果显示：18S和28S的条带清晰，隐约可见5S。提示RNA提取完整，无降解。

1.3.3 逆转录合成cDNA用Prime ScriptTMRT reagent kit，进行逆转录反应：

在0.1%DEPC处理的EP管中依次加入以下试剂：

5×PrimeScript Buffer2μl

PrimeScript RT Enzyme MIX I0.5μl

Oligo dT Primer0.5μl

Random 6mers0.5μl

Total RNA4μl

Rnase Free dH2O2.5μl

反转录反应条件：37℃水浴15min（逆转录反应），后置于85℃5sec（使反转录酶的失活反应）。置于-20℃冰箱冻存备用。

1.3.4 聚合酶链式反应（PCR）ING4基因检测引物序列、产物长度和PCR反应条件，以β-actin作为对照。见表1、表2。

PCR反应体系

10×Buffer(15mM MgCl2)5.0μl

dNTP(2.0mM)4.0μl

上、下游引物各1.0μl

Taq酶0.5μl

模板(cDNA)5.0μl

用无核酶水定容至25.0μl

加无菌石蜡油25.0μl

表1 PCR引物序列

表2 PCR反应条件

1.3.5 琼脂糖凝胶电泳取扩增产物10μl点样，2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色显示，在透射紫外光分析仪下摄影，并用激光光密度图象扫描仪扫描。

1.3.6 凝胶分析定量计算方法为：所得ING4扩增产物的条带与β-actin扩增产物的条带的综合灰度之比代表mRNA的表达水平。

1.3.7 质量控制设立了空白对照组、阴性对照组和内对照组。空白对照：用DEPC水替代cDNA进行PCR扩增。阴性对照组：以RNA替代cDNA用于PCR扩增。内对照组：以β-actin引物，扩增的cDNA，证实提取的RNA产物是否可以用于扩增目的DNA。

1.3.8 免疫组织化学方法免疫组织化学试剂一抗采用英国Abcom公司生产的ING4多克隆抗体。检测系统也采用福建迈新公司的Elivision试剂盒。石蜡切片厚度3μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，蒸馏水浸泡5min，3%过氧化氢室温孵育10min阻断内源性过氧化酶的活性，PBS液冲洗，高压锅抗原修复，自然冷却至室温。加入二步法Elivision试剂盒中试剂A，室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次5min，加入试剂盒中试剂B，室温下孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min。镜下控制DAB显色，蒸馏水冲洗终止反应。苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗返蓝，脱水，透明，中性树胶封片，每次均做阳性对照及PBS代替一抗做阴性对照。

1.3.9 免疫细胞化学判断的标准定位准确，呈棕黄色颗粒为阳性，ING4阳性定位于细胞核，阳性细胞小于10%为（-），11%～25%为（+），26%～50%为（++），51%～75%为（+++），76%～100%为（++++）

1.4 统计分析方法RT-PCR实验重复3次，RTPCR实验的图片用Image tool软件进行灰度值分析，实验数据采用t检验分析，P＜0.05为差别有统计学意义。实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行处理。

2 结果

2.1 RT－PCR方法检测胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING4mRNA的表达情况RT-PCR技术测定胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING4mRNA表达情况（见图1）。各组中ING4与β-actin光密度比值平均值分别为0.32、0.51、0.56和0.78（见表3）。胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING4mRNA的量也依次增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING4 mRNA表达情况（x±s）

图1 胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING4 mRNA表达情况

2.2 免疫组织化学方法检测胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING4蛋白的表达情况62例ING4免疫组织化学结果(见图2)：高危组阳性3例（阳性率18.8%）；中危组阳性6例（阳性率26.1%）；低危组阳性10例（阳性率55.6%）；极低危组阳性3例（阳性率60%）。胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING蛋白表达阳性率也依次增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

ING4是2003年新发现的抑癌基因[1-3]。它参与调节P53活性、肿瘤血管的增生、细胞对缺氧状态的适应、细胞接触抑制的丢失以及细胞对化学药物敏感性等影响肿瘤的发生、生长及对肿瘤治疗的多个方面[4-12]。ING4蛋白和p53形成转录复合物，从而激活p53基因，介导细胞的生长和修复；HIF的异常表达或者激活后通过促进血管形成、糖酵解、细胞增生和分裂等过程促进肿瘤的发展，ING4直接和HIF的羟化，而抑制肿瘤生长[13，14]；过度表达ING4可以显著负性调节处于G2M停止期细胞，而促进细胞凋亡[12-15]。

图2 ING4免疫组织化学结果（×200）

本实验采用RT-PCR方法和免疫组织化学的方法检测ING4 mRNA和ING4蛋白在胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中的表达情况，发现胃肠道间质瘤高危组、中危组、低危组和极低危组中ING4 mRNA和ING4蛋白表达阳性率也依次增加，差别有统计学意义（P＜0.05）。

胃肠道间质瘤目前评价恶性程度主要是依据肿瘤部位、大小、核分裂像和有无肿瘤性坏死，而缺乏免疫组织化学指标的支持，本实验结果证实随着胃肠道间质瘤恶性程度的增加，ING4 mRNA和ING4蛋白的表达降低。ING4可以作为一个新的评价胃肠道间质肿瘤恶性程度的指标。

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R735.3，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0337-03

2016-12-26；

2017-05-01)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.013

江西省卫计委资助课题，编号：20167204

彭芳，女，1985年生，主治医师，病理与病理生理学专业，硕士研究生。

杨人泽，男，1975年生，主任药师，硕士学位。研究方向为医院药学和临床药学。