人参皂苷Rb3联合β-细辛醚对血管性痴呆模型小鼠的改善作用及其机制研究

邓敏贞 钟晓琴 高志杰 孙一凡 黄丽平

摘 要 目的：研究人參皂苷Rb3联合β-细辛醚对血管性痴呆（VD）模型小鼠的改善作用及其机制。方法：将ICR小鼠随机分为模型组、人参皂苷Rb3组（10 mg/kg）、β-细辛醚组（10 mg/kg）、联合用药组（人参皂苷Rb3 10 mg/kg +β-细辛醚10 mg/kg）、阳性对照组（盐酸多奈哌齐1 mg/kg）和蛋白激酶B（Akt）抑制剂组（LY294002，1 mg/kg），并设假手术组，每组10只。除假手术组外，其余各组小鼠均按四血管阻断法复制VD模型。造模后，假手术组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，Akt抑制剂组腹腔注射相应药物，其余各组均灌胃相应药物，每日2次，连续30 d。末次给药后，采用避暗实验检测各组小鼠的学习记忆能力，酶联免疫吸附测定法检测其海马组织中4-羟基壬烯酸（4-HNE）、 8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）、活性氧（ROS）含量，实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测海马组织中B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）及其X蛋白（Bax） mRNA的表达，免疫荧光法检测皮质中Bcl-2蛋白的表达，Western blotting法检测海马组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果：与假手术组比较，模型组小鼠的避暗潜伏期显著缩短，错误次数显著增多，4-HNE、8-OHdG、ROS含量以及Bax mRNA、蛋白的表达水平均显著升高，Bcl-2 mRNA、蛋白的表达水平均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，人参皂苷Rb3组、β-细辛醚组、联合用药组和阳性对照组小鼠的避暗潜伏期均显著延长，错误次数均显著减少，4-HNE、8-OHdG、ROS含量以及Bax mRNA、蛋白的表达水平均显著降低，Bcl-2 mRNA、蛋白的表达水平均显著升高，且联合用药组的效果最为显著（P<0.05或P<0.01）;而Akt抑制剂组小鼠的避暗潜伏期显著缩短，错误次数显著增多，4-HNE、8-OHdG、ROS含量以及Bax mRNA、蛋白的表达水平均显著升高，Bcl-2 mRNA、蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）。结论：人参皂苷Rb3联合β-细辛醚对VD模型小鼠学习记忆能力具有一定改善作用，且效果优于各化合物单用。这种作用可能与抗氧化应激、抗海马组织凋亡有关。

关键词 人参皂苷Rb3;β-细辛醚;血管性痴呆;氧化应激;凋亡;小鼠

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the improvement effects of ginsenoside Rb3 combined with β-asarone on vascular dementia （VD） model mice and its mechanism. METHODS： ICR mice were randomly divided into model group， ginsenoside Rb3 group （10 mg/kg）， β-asarone group （10 mg/kg）， drug combination group （ginsenoside Rb3 10 mg/kg+β-asarone 10 mg/kg）， positive control group （donepezil hydrochloride 1 mg/kg） and Akt inhibitor group （LY294002， 1 mg/kg）， and sham operation group was set up， with 10 mice in each group. Except for sham operation group， VD model was induced by four vessel occlusion method in other groups. After modeling， sham operation group and model group were given constant volume of normal saline， Akt inhibitor group was given relevant medicine intraperitoneally， and other groups were given relevant medicine intragastrically， twice a day， for consecutive 30 d. After last administration， the learning and memory ability of mice was detected by avoiding darkness test. The contents of 4-hydroxydecenoic acid （4-HNE）， 8-hydroxydeoxyguanosine （8-OHdG） and reactive oxygen species （ROS） in hippocampus was detected by ELISA. RT-PCR assay was used to detect the mRNA expression of Bcl-2 and Bax in hippocampus. The protein expression of Bcl-2 in cortex was detected by immunofluorescence method. Western blotting assay was used to detect the protein expression of Bcl-2 and Bax in hippocampus. RESULTS： Compared with sham operation group， the incubation period of avoiding darkness test in model group was shortened significantly; and the number of errors was increased significantly; 4-HNE， 8-OHdG and ROS contents， mRNA and protein expression of Bax were increased significantly， and mRNA and protein expression of Bcl-2 was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the incubation period of avoiding darkness test was prolonged significantly in ginsenoside Rb3 group， β-asarone group， drug combination group and positive control group， the number of errors was decreased significantly; 4-HNE， 8-OHdG， ROS contents， mRNA and protein expression of Bax were decreased significantly， and mRNA and protein expression of Bcl-2 were increased significantly， especially in drug combination group （P<0.05 or P<0.01）. But the incubation period of avoiding darkness test was shortened significantly in Akt inhibitor group， and the number of errors was increased significantly; 4-HNE， 8-OHdG， ROS contents， mRNA and protein expression of Bax were increased significantly， and mRNA and protein expression of Bcl-2 were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Ginsenoside Rb3 combined with β-asarone has a protective effect on VD model mice， and the effect was better than that of each compound alone. The mechanism of which may be associated with anti-oxidative stress and anti-apoptosis of hippocampus.

KEYWORDS   Ginsenoside Rb3; β-asarone; Vascular dementia; Oxidative stress; Apoptosis; Mice

血管性痴呆（Vascular dementia，VD）是一种由缺血性脑血管疾病所致脑组织局部脑血流量减少、缺氧等因素所造成的中枢神经功能障碍性疾病，主要临床表现为认知功能障碍[1]。研究发现，VD和散发性阿尔茨海默病的共同始动环节是慢性脑组织血液供应不足[2]。目前，临床尚无理想的防治认知功能障碍的药物。中药复方由于具有多途径、多靶点的作用特点，对痴呆疾病的预防和治疗具有一定的优势[3]，故有潜在的开发价值。

人参发挥药效的主要物质基础是人参总皂苷，其中人参皂苷Rb类成分的含量较高。有研究发现，人参总皂苷具有提高学习记忆的能力[4]。石菖蒲临床广泛用于中风后遗症、健忘等神经系统疾病的治疗[5]。β-细辛醚作为石菖蒲挥发油的主要活性成分，具有保护心血管、易透过血脑屏障等特点，在心脑血管疾病的防治中具有重要价值[6]。人参和石草蒲都是益智古方定志小丸的主要成分[7]。本课题组前期研究发现，人参总皂苷联合石菖蒲挥发油可有效改善痴呆模型小鼠的学习记忆能力[8];此外有研究证实，β-细辛醚可减缓痴呆模型小鼠的认知功能障碍[9-10]，人参皂苷Rb3对心脏血管再灌注和大腦缺血再灌注损伤有一定的保护作用[11-12]。在上述研究的基础上，本文主要探索人参皂苷Rb3与β-细辛醚联用对VD模型小鼠的改善作用，并初步研究其作用机制，以期为治疗VD的新药开发提供试验依据。

1 材料

1.1 仪器

SBA-2 型小鼠避暗仪（中国医学科学院药物研究所）;IKA T10基础型分散机（德国IKA公司）;5804R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）;ME403型电子天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司];Biotek-EON型酶标仪（美国Bio Tek公司）;CFX96型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Bio Rad公司）;TI2-E型全自动倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 药品与试剂

人参皂苷Rb3对照品、β-细辛醚对照品（四川维克奇生物技术有限公司，批号：wkq18020701、wkq18042602，纯度均大于98%）;盐酸多奈哌齐片[卫材（中国）药业有限公司，批号：1706077，规格：5 mg];LY294002[蛋白激酶B（Akt）抑制剂，美国Med Chem Express公司，批号：154447-36-6];水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20170414）;4-羟基壬烯酸（4-HNE）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：UK92FFJBWN）;8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号：C22013999）;活性氧（ROS）ELISA试剂盒（南京草本源生物科技有限公司，批号：07/2019）;Trizol试剂（美国Invitrogen公司，批号：191012）;PrimeScriptTM RT Reagent Kit、SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ[宝生物工程（大连）有限公司，批号：RR037A、RR820A];B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）及其X蛋白（Bax）、β-肌动蛋白（β-actin）基因引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成;4%多聚甲醛（广州晶欣生物科技有限公司，批号：JX0100）;兔源Bcl-2克隆抗体（批号：ab182858和#3498S）、兔源Bax抗体（批号：#2772S）多克隆、兔源GAPDH单克隆抗体（批号：5174S）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（批号：7074S）均购自美国CST公司;SABC-FITC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：SA1062）;生理盐水（辰欣药业股份有限公司，批号：1910242706）;蛋白裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0013B）;其余试剂均为分析纯，水为纯净水。

1.3 动物

SPF级ICR小鼠70只，雄性，3月龄，体质量（25±2）g，由广东省医学动物实验中心提供，动物生产许可证号为SCXK（粤）2014-0035。所有小鼠均适应性饲养3 d再进行后续实验。本实验方案通过广东省中医院实验动物伦理委员会审核同意。

2 方法

2.1 造模

参考相关文献[13]按四血管阻断法复制VD模型。腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）进行麻醉，分离小鼠双侧颈总动脉，用动脉夹阻断其血流30 min，松开动脉夹恢复血流10 min，重复3次。于第1次阻断血流5 min后，断尾放血约0.3 mL。于第3次缺血再灌注后30 min，观察小鼠呼吸、心跳，待其恢复正常后即可缝合皮肤。

2.2 分组与给药

根据前期预实验结果设置给药剂量。将60只VD模型小鼠随机分为模型组、人参皂苷Rb3组（10 mg/kg）、β-细辛醚组（10 mg/kg）、联合用药组（人参皂苷Rb3 10 mg/kg+β-细辛醚10 mg/kg）、阳性对照组（盐酸多奈哌齐，1 mg/kg）和Akt抑制剂组（LY294002，1 mg/kg），并另设假手术组（按“2.1”项下方法操作，但不行缺血再灌注），每组 10 只。模型组和假手术组小鼠灌胃等体积生理盐水，Akt抑制剂组小鼠腹腔注射相应药物，其余各组小鼠灌胃相应药物，每日2次，连续30 d。

2.3 小鼠学习记忆能力评价

采用避暗实验评价各组小鼠的学习记忆能力。第29天给药结束后，将各组小鼠置于避暗仪中适应2 min 后，将其背对暗室的洞口放入明室。小鼠进入暗室，受到电击后逃出暗室，如此训练5 min。24 h后（即末次给药后）正式检测，将每只小鼠分别置于明室，记录其从明室第1次进入暗室的时间（避暗潜伏期）和5 min内小鼠进入暗室的次数（错误次数）。

2.4 小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG、ROS含量检测

采用ELISA法检测各组小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG、ROS含量。避暗实验结束后，颈椎脱臼处死各组小鼠，迅速取出其左侧海马组织，精密称定质量后以生理盐水制成10%海马组织匀浆，于4 ℃、3 500 r/min条件下离心15 min，吸取上清液，使用酶标仪检测各组小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG、ROS含量。严格按照相应试剂盒说明书操作。

2.5 小鼠海马组织中Bcl-2、Bax mRNA表达情况检测

采用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠海马组织中Bcl-2、Bax mRNA表达情况。取各组小鼠右侧部分海马组织，按照Trizol试剂盒操作提取总RNA，根据PrimeScriptTM RT Reagent Kit说明书操作逆转录得cDNA，置PCR仪中进行扩增。反应体系（共25 μL）：2×SYBR? Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40次循环。以β-actin为内参，使用2-ΔΔCt法分析各组小鼠海马组织中Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。引物序列及产物长度见表1。

2.6 小鼠皮质中Bcl-2蛋白表达情况检测

采用免疫荧光法检测各组小鼠皮质中Bcl-2蛋白表达情况。各组随机取3只小鼠左侧大脑皮质置于4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水，石蜡包埋、切片、脱蜡至水后，于3%双氧水中浸泡30 min，用柠檬酸钠进行抗原修复，恢复室温后用组化笔划圈，磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）漂洗3次，每次5 min，随后滴加正常山羊血清，室温下孵育30 min，不漂洗直接滴加Bcl-2一抗（稀释比例为1 ∶ 50），37 ℃孵育2 h;PBS漂洗3次，每次5 min;滴加生物素（稀释比例为1 ∶ 100），室温孵育30 min;滴加SABC-FITC（稀释比例为1 ∶ 200），室温避光孵育30 min;PBS漂洗3次，每次5 min。用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室温避光孵育5 min，PBS漂洗3次，每次5 min，最后用防荧光淬灭封片，在荧光显微镜下观察Bcl-2荧光强度并以阳性细胞百分比表示其蛋白表达水平。

2.7 小鼠海马组织中Bcl-2和Bax蛋白表达情况检测

采用Western blotting法检测各组小鼠海马组织中Bcl-2和Bax蛋白表达情况。各组随机取3只小鼠右侧海马组织，称定质量，加入现配的含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，冰上匀浆促其充分裂解，于4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取其上清液以BCA法检测蛋白质浓度。取煮沸变性后的蛋白样本40 μg，以10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，湿法转膜，再以5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，加入Bcl-2、Bax、GAPDH一抗（稀释比例均为1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育过夜，再用TBST溶液清洗;加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗于室温下孵育1 h，再用TBST溶液清洗。经ECL化学发光液显影和定影后采用Image J 8.0软件分析，以目标蛋白与内标（GAPDH）的灰度值比值表示该蛋白的表达水平。

2.8 统计学方法

采用SPSS 17.0軟件对数据进行统计分析。所有数据均以x±s表示，两两比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠学习记忆能力

与假手术组比较，模型组小鼠的避暗潜伏期显著缩短，错误次数显著增多（P<0.01）。与模型组比较，人参皂苷Rb3组、β-细辛醚组、联合用药组和阳性对照组小鼠的避暗潜伏期均显著延长，错误次数均显著减少（P<0.05或P<0.01）;而Akt抑制剂组小鼠的避暗潜伏期显著缩短，错误次数显著增多（P<0.05）。与人参皂苷Rb3组、β-细辛醚组、Akt抑制剂组比较，联合用药组小鼠的避暗潜伏期显著延长，错误次数显著减少（P<0.05或P<0.01）。各组小鼠学习记忆能力的变化情况见表2。

3.2 小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG和ROS含量

与假手术组比较，模型组小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，人参皂苷Rb3组、β-细辛醚组、联合用药组和阳性对照组小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均显著降低（P<0.01）;而Akt抑制剂组小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均显著升高（P<0.05或P<0.01）。与人参皂苷Rb3组、β-细辛醚组、Akt抑制剂组比较，联合用药组小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均显著降低（P<0.05或P<0.01）。各组小鼠海马组织中4-HNE、8-OHdG、ROS含量的检测结果见表3。

3.3 小鼠海马组织中Bcl-2、Bax mRNA表达水平

与假手术组比较，模型组小鼠海马组织中Bcl-2 mRNA表达水平显著降低，Bax mRNA表达水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较，人参皂苷Rb3组、β-细辛醚组、联合用药组和阳性对照组小鼠海马组织中Bcl-2 mRNA表达水平均显著升高，Bax mRNA表达水平均显著降低（P<0.01）;而Akt抑制剂组小鼠海马组织中Bcl-2 mRNA表达水平显著降低，Bax mRNA表达水平显著升高（P<0.05）。与人参皂苷Rb3组、β-细辛醚组、Akt抑制剂组比较，联合用药组小鼠海马组织中Bcl-2 mRNA表达水平显著升高，Bax mRNA表达水平显著降低（P<0.05或P<0.01）。各组小鼠海马组织中Bcl-2、Bax mRNA表达水平的检测结果见表4。

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（收稿日期：2020-03-26 修回日期：2020-07-02）

（编辑：邹丽娟）