甲状腺乳头状癌病理特征与BRAF V600E基因突变的相关性

张 哲 佟凌霞 李朝军 汪晓春

甲状腺乳头状癌是甲状腺癌最常见的组织学类型，可占到所有甲状腺癌的85%以上[1]，多发生于女性，近年来的发生率有着明显的上升趋势。现代研究表明肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，由多因素、多阶段、多步骤共同参与，不仅与细胞凋亡与细胞增殖的动态失衡相关，也与原癌基因的激活和抑癌基因的灭活有关[2-3]。BRAF基因突变是甲状腺癌最常见也是最有特异性的基因改变，可能决定乳头状癌的临床和病理表现[4-5]。当前有研究显示BRAF V600E基因突变率与甲状腺乳头状癌的侵袭、转移、复发等不良预后关系密切[6-8]。本文具体探讨了甲状腺癌病理特征与及分子标志物BRAF V600E基因的相关性，希望为从分子水平判断患者的病情提供参考。现总结报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

调取本院2017年1月至2018年12月年收治的甲状腺外科手术治疗患者共184例，其中甲状腺乳头状癌患者60例(甲状腺癌组)，良性甲状腺肿124例(甲状腺肿组)。纳入标准：医院伦理委员会批准了此次研究；所有入选者的临床病历资料完整；都有明确的病理检查结果；年龄在20～80岁之间；入选者纳入研究前未接受过手术、放疗、化疗或者激素治疗；入选者在自愿条件下签署了知情同意书。排除标准：妊娠与哺乳期妇女；临床资料与病理学资料缺项者；合并其他系统肿瘤病史；合并心、肺、肝、胃等重要脏器的疾病。

甲状腺肿组：男性40例，女性84例；年龄最小29岁，最大78岁，平均(59.11±2.879)岁，平均体重指数(22.10±2.19)kg/m2。

甲状腺癌组：男性18例，女性42例；年龄最小28岁，最大77岁，平均年龄(58.23±4.11)岁，平均体重指数(22.83±1.23)kg/m2；临床分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期20例，Ⅲ期6例；分化程度：低分化21例、中分化19例、高分化20例；淋巴结转移15例；包膜浸润20例。

2组患者的性别、年龄、体重指数对比差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 分子标志物检测

取所有患者的外周空腹静脉血1～2 ml，分离全血组织。使用QIAGEN血液基因组DNA抽提试剂盒快速高效分离基因组DNA，利用特异双扩增技术对BRAF V600E进行PCR检测。BRAF V600E正向引物：5’-ATTTGGCCTAGCTCCTAA-3’，反向引物：5’-CGTCTTTACCCAGCAGTGT-3’。PCR过程：95 ℃10 min酶活化，后续40 cycles，95 ℃15 s，延伸60 ℃ 1 min，检测设备为ABI 7500荧光定量PCR仪，PCR试剂盒为BRAF V600E突变检测试剂盒(上海生工公司)，若样本信号Ct≥28，则样本为阴性；若样本的信号Ct值<28，则样本为阳性。

1.3 病理特征调查

调查所有患者的良恶性状况，均经2名病理医生重复观片共同确定病理诊断。记录甲状腺癌组患者的病理特征，包括临床分期、分化程度、淋巴结转移、包膜浸润等。

1.4 统计方法

应用SPSS 22.00 for windows软件包进行统计学数据分析，计量数据与计数数据以均数±标准差、率等表示，对比为t检验与卡方χ2分析，影响因素采用多因素logistic回归分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 BRAF V600E基因突变率对比

甲状腺癌组患者的BRAF V600E基因突变率为55.0%(33/60)，显著高于甲状腺肿组的6.5%(8/124)，差异有统计学意义(χ2=55.033，P<0.05)。

2.2 BRAF V600E基因突变率与病理特征的相关性

在甲状腺癌组60例患者中，随着临床分期增加、分化程度降低、淋巴结转移与包膜浸润，BRAF V600E基因突变率显著增加，对比差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 甲状腺癌组患者BRAF V600E基因突变率与病理特征的相关性(例，%)

2.3 影响因素分析

在甲状腺癌组60例患者中，以BRAF V600E基因突变率作为因变量，以病理特征为自变量，多因素logistic回归分析显示临床分期(Ⅱ期/Ⅲ期)、分化程度(低分化)、淋巴结转移、包膜浸润都为影响患者BRAF V600E基因突变率的因素(P<0.05)，见表2。

表2 影响甲状腺癌组患者BRAF V600E基因突变率的因素分析(n=60)

3 讨论

甲状腺乳头状癌是目前最常见的女性恶性肿瘤之一，发病率在我国逐渐增加。当前甲状腺癌的病因尚不十分清楚，其中经历了多步骤、多阶段、多因素、多基因变异参与的复杂的生物学演变过程，发病机制非常复杂[9-10]。该病病灶组织在显微镜下多有纤维瘢痕组织，形态不规则，排列拥挤，细胞核淡染，乳头中心可见同心圆结构的砂粒体。由于部分患者的病灶形态特征不明显，特别是呈滤泡状排列的病例，需要与甲状腺肿相鉴别[11-12]。

BRAF V600E属抑癌基因，可以通过p53促使细胞周期抑制因子p21的表达，还能快速定位并通过同源重组和非同源末端连接等途径修复损伤DNA，阻止受损细胞进入下一周期[13]。BRAF V600E的表观丢失或表达位置变化可对细胞周期的调控及抑癌作用减弱，从而能造成甲状腺癌的发生[14]。当前细胞学标本或组织病理BRAF V600E基因检测突变是诊断甲状腺乳头状癌特异性很高的指标之一，此外BRAF V600E基因突变阳性的甲状腺乳头状癌较BRAF V600E基因突变阴性的甲状腺乳头状癌更具侵袭性，更易发生颈部淋巴结的转移[15-16]。本研究显示甲状腺癌组患者的BRAF V600E基因突变率为55.0%，显著高于甲状腺肿组的6.5%，表明甲状腺乳头状癌患者多伴随有BRAF V600E基因突变。也有研究表明BRAF V600E基因突变仅存在于甲状腺恶性肿瘤，以甲状腺乳头状癌的突变率最高，而在正常甲状腺组织及甲状腺良性病变中并不存在[17-18]。

甲状腺乳头状癌的临床分期、包膜浸润、淋巴结转移等已是判断甲状腺癌病情的重要因素[19]。本研究显示在甲状腺癌组60例患者中，随着病理分期增加、分化程度降低、淋巴结转移与包膜浸润，BRAF V600E基因突变率显著增加，对比差异有统计学意义；多因素logistic回归分析显示临床分期、分化程度、淋巴结转移、包膜浸润都为影响患者BRAF V600E基因突变率的因素，表明BRAF V600E基因突变率与甲状腺乳头状癌的病理类型显著相关。当前也有研究显示BRAF V600E基因突变可导致多种基因表达紊乱，与肿瘤细胞上皮间质转化、耐药性等密切相关[20]，也可影响并修饰基质细胞，募集肿瘤相关的基质细胞，从而促进肿瘤的发生与进展[21-22]。不过任何单一的分子标志物对检测甲状腺乳头状癌的效果都不能十分满意，而指标的联合检测有助于提高甲状腺乳头状癌的早期诊断准确率。同时由于甲状腺乳头状癌病灶较小，所以在病理取材时，应尽量选择多个切面，以免漏诊。

总之，甲状腺乳头状癌患者多伴随有BRAF V600E基因突变，与患者的病理特征显著相关，可用于辅助判断患者的病情。