七氟醚通过靶向miR-203调控ERK/MMP-9通路抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭

何世华 尚晓宁 苗良生

结直肠癌(CRC)是全球范围内最常见的具有高转移性的恶性肿瘤之一。七氟醚是1种挥发性麻醉剂，据报道其在非小细胞肺癌和肾癌的转移中具有重要的调控作用[1]。microRNAs(miRNAs)是一类具有21～25个核苷酸的小型非编码RNA，它们对CRC的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学过程具有重要的作用。此外，研究发现miRNAs参与多种癌症中七氟醚介导的生物学过程。如miR-637通过调节蛋白激酶B途径介导七氟醚对神经胶质瘤细胞迁移和侵袭的作用[2]。miR-203作为一种肿瘤抑制因子，可调控非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭[3]，而且miR-203也介导七氟醚对乳腺癌细胞增殖的调控[4]。本文旨在研究七氟醚对CRC细胞迁移和侵袭的影响，并探讨miR-203在其中的调控作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及干预方式

人CRC细胞系SW620购自美国ATCC公司。将细胞培养在含有10%胎牛血清及双抗的DMEM培养基中，与37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，待细胞汇合度达到90%以上时，进行传代培养，每隔2～3天换一次培养基。取第3～5代生长稳定的细胞用于后续试验。

将细胞以每孔5×105个细胞(1 ml/孔，5×105/ml)接种于6孔板中，培养24 h后，随机分为2组：对照组和七氟醚组，n=4。将培养板置于密闭容器中，于37 ℃恒温水浴锅中，密闭容器进气口连接麻醉机，通入气体。采用气体检测仪监测通入七氟醚的浓度。七氟醚组通入4%的七氟醚、5% CO2～95% O2，对照组通入5% CO2～95% O2，气体流量均为1 μl/min，持续通入6 h。然后细胞在进行常规培养24 h。

1.2 划痕实验

将2组处理后的细胞制备成细胞悬液并计数，以1×106个/皿的浓度将细胞接种于60 mm的小皿中，培养过夜。用无菌的200 μl的枪头在垂直于细胞生长方向划痕，用预冷的PBS洗3次，继续于37 ℃培养48 h后，在倒置显微镜下拍照。计算迁移速率(m/h)=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/48 h。

1.3 Transwell细胞侵袭实验

将用无血清培养基配制的Matrigel胶预先平铺于Transwell上、下小室之间。将2组处理好的细胞用无血清培养基制备成细胞悬液并计数。取2×105/ml个细胞200 μl加入Transwell上小室中，下小室中充满含20%胎牛血清的培养基，于37 ℃培养24 h后，用4%多聚甲醛室温固定20 min，0.1%结晶紫室温染色20 min，200光镜下计数，随机选取10个视野，统计细胞数。

1.4 Western Blot

采用RIPA裂解液从各组细胞中提取总蛋白，BCA试剂盒进行总蛋白定量分析。将20 g的总蛋白加入上样缓冲液，用10%的SDS-PAGE凝胶分离，转膜至PVDF膜上，用5%的胎牛血清封闭45 min，于4 ℃孵育一抗过夜，TBST洗3次，室温摇床孵育二抗1 h，TBST洗3次，用电化学发光试剂ECL暗室发光。采用凝胶成像系统和Image J软件统计分析条带。β-actin为内参，p-ERK、ERK、β-actin抗体及二抗均购自上海碧云天公司，MMP-9、Robo1抗体购自美国Abcam公司。

1.5 实时荧光定量PCR

采用TriZol试剂从各组细胞中提取总RNA，用M-MLV反转录酶合成第一链cDNA，用SYBR green荧光染料进行定量PCR扩增。根据2-Ct公式计算目的基因的相对表达量，miR-203的内参用U6，Robo1的内参用β-actin。引物由Primer designing tool软件设计，由上海生工生物工程公司合成。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 七氟醚对CRC细胞迁移能力的影响

如图1所示，七氟醚组的细胞迁移速率(7.995±0.165)m/h显著低于对照组的细胞迁移速率(4.07±0.17)m/h。

图1 2组细胞迁移能力对比

2.2 七氟醚对CRC细胞侵袭的影响

如图2所示，七氟醚组穿透Matrigel基质胶的细胞数[(95.496±5.502)个]，显著低于对照组[(48.391±3.605)个]。

2.3 七氟醚对CRC细胞ERK/MMP-9通路的影响

如表1所示，与对照组相比，七氟醚组p-ERK和MMP-9的表达显著降低(P<0.05)，而七氟醚组ERK的表达无显著变化。

2.4 七氟醚对CRC细胞miR-203及其靶基因的影响

如图3所示，根据TargetScan在线软件的预测结果，miR-203可与Robo1 3’UTR端结合，且在Robo1 3’UTR端有2个结合位点550～557和1441～1448。如表2所示，qRT-PCR及Western Blot结果显示，与对照组相比，七氟醚组miR-203的表达显著增加(P<0.05)，而Robo1 mRNA和Robo1蛋白的表达显著降低(P<0.05)。

图2 2组细胞侵袭能力对比

表1 2组ERK/MMP-9通路分子表达对比

表2 2组miR-203及其靶基因表达的对比

3 讨论

在体外研究中，七氟醚可影响非小细胞肺癌、肾癌和神经胶质瘤等多种癌细胞的转移潜能[1,5]，因此本研究试图探讨七氟醚对CRC细胞迁移和侵袭的影响，划痕实验和Transwell侵袭实验表明4%七氟醚可显著抑制CRC细胞的迁移和侵袭。这与Xu等的研究一致，七氟醚可抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭，诱导其凋亡[6]。ERK信号参与七氟醚调控的多种生物学过程[7]，因此我们推测七氟醚可能通过ERK途径抑制CRC细胞的迁移和侵袭，为了验证此推测，我们检测2组中p-ERK和ERK蛋白的表达，结果发现七氟醚可显著抑制p-ERK蛋白的表达，而对ERK蛋白的表达无显著影响，这些结果提示七氟醚可抑制ERK通路的活性，进一步证明七氟醚可通过阻断ERK途径抑制CRC的迁移和侵袭。

miR-203在多种癌症中即可作为致癌因子，也可作为抑癌因子。例如miR-203作为致癌因子促进卵巢癌的生长及迁移[8]。但是目前越来越多的研究报道miR-203作为抑癌因子参与CRC的发展过程，例如miR-203可通过调节真核起始因子5A2抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭[9]，此外miR-203也可通过调节锌指蛋白217抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭[10]。这样相反的作用效果可能是由于肿瘤环境的不同造成的。之前的研究也建议miRNAs的失调与七氟醚的调节有关[2,4]，本研究也发现七氟醚可显著上调CRC细胞中miR-203的表达，这也符合之前的报道，七氟醚通过上调miR-203的表达抑制乳腺癌细胞的增殖[6]。此外，在胃癌中miR-203和ERK通路之间也有潜在的调节作用[11]。因此我们推测ERK通路的激活与七氟醚上调miR-203进而抑制CRC的迁移和侵袭有密切的关系。当然详细的信号通路研究还有进一步开展，如miR-203阻断或者ERK通路阻断是否对七氟醚调控的CRC细胞迁移和侵袭有影响作用。

据报道MMPs在癌细胞的迁移、生长、炎症等过程中具有至关重要的调节作用。MMP-9参与肌醇六磷酸刺激的CRC细胞的迁移和侵袭过程有关[12]，而且ERK通路有助于MMP-9诱导多种癌症转移[13]。因此我们推测MMP-9可能也参与七氟醚对CRC细胞的调节过程，通过对本研究2组细胞中MMP-9表达的检测发现，七氟醚可显著抑制MMP-9的表达。结合之前的文献报道，我们推测七氟醚通过阻断ERK通路，进而抑制MMP-9的表达，最终抑制CRC细胞的迁移及侵袭。MMP-9是1种蛋白水解酶，其主要功能是降解细胞外基质中的Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶，促进肿瘤的侵袭和转移能力[14]。因此七氟醚抑制CRC细胞迁移和侵袭的机制可能与阻断ERK通路，进而抑制MMP-9介导的细胞外基质降解有关。

功能性miRNAs可通过与特定mRNA的3′-UTR端结合并调节此mRNA的表达。在骨肉瘤中Robo1与ERK通路有密切的关系[15]，而且据报道miR-203可在神经胶质瘤细胞中可靶向Robo1和ERK/MMP-9通路[16]。因此我们推断Robo1可能是miR-203的下游靶点，参与调节七氟醚对CRC细胞迁移和侵袭的影响。通过TargetScan在线软件软件分析显示，miR-203可与Robo1 3’UTR端的2个位点550～557和1441～1448结合。而且七氟醚可显著抑制Robo1 mRNA和Robo1蛋白的表达。这些研究及结果提示，miR-203可通过靶向Robo1的3’UTR端，抑制Robo1的表达，进而参与七氟醚对CRC细胞迁移和侵袭的调控。且miR-203/Robo1对ERK/MMP-9通路的调控可能是此过程的分子机制。本研究还有一些不足之处，例如对分子机制的探讨还不够彻底、缺乏动物实验的研究，另外目前认为肿瘤干细胞是多种癌症(包括CRC)治疗失败、转移及复发的源头，七氟醚是否对肿瘤干细胞也有同样的调节作用是我们将来要研究的内容之一。

图3 miR-203及其靶基因Robo1结合位点的预测图

总之，本研究表明七氟醚可抑制CRC细胞的迁移和侵袭，机制可能与其调控miR-203/Robo1的表达，进一步阻断ERK/MMP-9通路有关。