程序死亡因子1及配体水平变化在喉癌发生发展中的作用

朱 清 李世东 朱旭利

喉癌(laryngeal cance)以鳞状细胞癌最为常见，临床表现为声嘶、呼吸困难、咳嗽、吞咽困难、颈部淋巴结转移等，早期发现、尽早诊断和治疗对减轻喉癌的危险十分重要，一方面可明显提高患者术后的生存率，其次可最大程度保留喉的发音功能，减少术后并发症[1]。程度死亡因子1属于CD28的家族成员，其配体有PD-L1和PD-L2，其中前者与PD-1结合后能够传递负性调控信号，抑制T细胞活化和增殖，并且促进T细胞凋亡，在机体免疫中发挥着至关重要的作用[2]。本研究旨在通过免疫组化法分析PD-1蛋白和PD-L1蛋白在喉癌发生、发展过程中的表达情况，并且分析其与患者病理特征之间的关系，以期探讨喉癌发生的可能机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

将我院自2018年6月至2019年6月间收治的经手术和组织病理学确诊为喉癌的64例患者作为研究组，选择同期入院体检存在声带息肉的患者61例作为对照组。研究组男性35例，女性29例，年龄36～78岁，平均年龄(48.81±5.29)岁；对照组男性34例，女性27例，年龄34～76岁，平均年龄(48.23±5.36)岁。2组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：所有患者经手术或组织病理学确诊为喉癌，在术前未接受过化疗或放疗。

排除标准：合并有咽喉部位其它炎性疾病、恶性肿瘤和存在手术禁忌证的患者。

1.3 主要仪器和试剂

仪器：组织包埋机、组织切片机、摊片机、烘片机、不锈钢压力锅、电磁炉、电热恒温培养箱、冷藏冰箱、光学显微镜、载玻片、盖玻片等。

试剂：PD-1兔抗人单克隆抗体ab137132，PD-L1兔抗人单克隆抗体ab205921，即用型免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒，磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.4)，EDTA抗原修复液pH9.0，石蜡，4%多聚甲醛、乙醇、二甲苯、伊红、苏木精等。

1.4 方法

所有采集的标本经4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋后切成4 μm厚度组织切片，再经脱蜡剂脱蜡，梯度浓度乙醇脱水，蒸馏水清洗，PBS浸泡，用EDTA高温高压抗原修复110 s，再用3%双氧水、封闭用山羊血清处理，加一滴1∶100兔抗人PD-1和PD-L1，置于4 ℃孵育过夜，再依次加入二抗、辣根过氧化物酶标记酶卵白素工作液，给予DAB显色，盐酸乙醇分化、反蓝和脱水处理，最后用中性树胶封片，每例实验重复进行2次[3]。

PD-1和PD-L1在组织中阳性显色评定标准为在细胞膜或细胞质中表现出淡黄色或棕褐色的颗粒，在肿瘤细胞或间质细胞内出现阳性显色；染色强度评分如下：细胞膜或胞质内出现淡黄色颗粒为弱染色，记1分；出现棕黄色颗粒为中等染色，记2分；出现棕褐色颗粒为强染色，记3分。随机选取5个400×的视野，每个视野100个肿瘤细胞或间质细胞中PD-1或PD-L1阳性显色强度≥2分的细胞数目≥5%时或阳性显色强度与阳性细胞数目相乘的结果≥10%时判定为该切片阳性表达[4]。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 HE染色结果

光镜下观察可见研究组患者癌细胞具有明显的结构异型性和细胞异型性，部分高分化鳞癌可见角化珠，对照组患者可见黏膜组织水肿，鳞状细胞仍整齐排列，无明显的结构和细胞异型性。

2.2 2组对象样本PD-1和PD-L1的表达情况

研究组PD-1表达阳性率为62.50%，明显高于对照组8.20%；PD-L1阳性表达率为68.75%，明显高于对照组13.11%，组间差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 2组对象样本PD-1和PD-L1的表达情况(例，%)

2.3 研究组样本PD-1和PD-L1表达情况的相关性分析

64例研究组患者中40例PD-1阳性表达的喉癌组织有37例为PD-L1阳性表达，经χ2检验可知喉癌组织中PD-1和PD-L1表达呈明显的正相关性(P<0.05)，见表2。

表2 研究组样本PD-1和PD-L1表达情况的相关性分析

2.4 喉癌组织PD-1和PD-L1表达和临床病理特征的关系

PD-1、PD-L1表达和喉癌临床分期和肿瘤分化程度密切相关，与患者癌组织发生部位无关，见表3。

表3 喉癌组织PD-1和PD-L1表达和临床病理特征的关系(例，%)

3 讨论

PD-1又名CD279，属于Ⅰ型跨膜蛋白，能够抑制机体免疫系统的功能，其实质为位于淋巴细胞表面的受体蛋白，主要位于T淋巴细胞表面，具有负向调节T淋巴细胞活性的功能，抑制T淋巴细胞增殖、分化，减少相关细胞因子的合成和分泌。PD-1有2种结合配体，分别为PD-L1和PD-L2，又名CD274，属于B7家族的成员之一，在活化的T、B细胞和其它免疫细胞表面广泛的表达；PD-L2为CD273，主要表达于活化的树突状细胞、巨噬细胞表面，因此PD-L1在体内发挥的作用要远远超过PL-L2[5]。机体内的免疫反应是一个复杂的现象，主要是由催化剂和抑制剂之间通路的调节活动达到平衡，其中PD-1和PD-L1是其中的一种抑制剂，能够抑制肿瘤特异性的T细胞发挥免疫效应，介导免疫逃逸机制[6]。

正常机体组织很少在细胞表面表达PD-L1蛋白，说明其转录是在机体生理免疫系统的严密监控下进行的，已经有研究证实，γ-IFN、TNF、IL-4、IL-10等多种细胞因子能够上调PD-L1在不同细胞中的表达，而且PD-1和PD-L1在多种恶性肿瘤患者中的表达率明显升高，而且其表达情况与部分恶性肿瘤的TNM分期和预后密切相关[7]。本次研究结果显示，喉癌患者PD-1表达阳性率为62.50%，PD-L1阳性表达率为68.75%，和对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，而且两者之间的表达呈明显的正相关性，PD-1和PD-L1在喉癌组织的表达程度与患者癌症临床分期和癌组织分化程度密切相关，临床分期越高、组织分化程度越高，阳性表达率越高，这一结果与文献报道基本一致[8-9]。由此可以证实，PD-1和PD-L1在喉癌的发生和发展过程中具有重要的作用，其中PD-L1可能减弱T细胞的功能和细胞凋亡，与机体内其他蛋白相互作用达到负性调节的作用，其信号通路可能与激活丝裂原活化蛋白激酶-分裂原活化抑制剂(MAPK-MEK)途径、表皮生长因子受体途径(EGFR)、信号转导及转录活化因子途径、C-JUN途径、钙离子信号途径和核转录因子途径有关[10]。

综上所述，PD-1和PD-L1在喉癌患者癌组织中具有较高的阳性表达率，两者表达呈明显的正相关，患者表达情况与其临床TNM分期和癌组织分化程度密切相关，可将其作为喉癌发生发展的指标。