miR-1247-3p通过靶向抑制B4GALT3促进乳腺癌细胞体外增殖、迁移与侵袭

李 妍 赵振慧 李 迅

乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一[1]，虽然近年来乳腺癌的治疗和诊断都有了显著的提高，但是肿瘤转移、耐药、预后较差等问题仍然存在[2]。并且介导乳腺癌发生发展的分子机制研究并不完善，所以发现新的肿瘤生物标志物，并完善其分子机制对于临床的诊断和治疗至关重要。MicroRNA(miRNA)是一类长度约为20～24个核苷酸的小RNA，可通过抑制其靶基因的表达水平而调控生物体内多种生物学进程，包括肿瘤的发生发展[3]。在肿瘤相关的MicroRNA中，miR-1247-3p已经被报道在肝癌等癌症高表达[4]，但是其在乳腺癌的表达和作用并没有报道，本研究通过探究miR-1247-3p在乳腺癌中的表达及对乳腺癌增殖和转移的影响，旨在为乳腺癌的研究和治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231(由新疆医科大学提供)；乳腺上皮细胞MCF10A(由新疆医科大学提供)；Tirzol(南京凯基生物技术有限公司)；CCK8试剂盒(沈阳万类生物技术有限公司)；EvaGreen miRNA qPCR试剂盒、miRNA cDNA Synthesis 试剂盒(苏州吉玛基因股份有限公司)；B4GALT3，GAPDH抗体，山羊抗鼠二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；电泳仪(南京大学仪器厂)；微型垂直电泳槽(上海天能科技有限公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；Transwell小室(福麦斯生物技术有限公司)，miR-1247-3p引物、mimic、inhibitor、negative control、B4GALT3的siRNA(由吉玛基因有限公司合成)；转染试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)。

1.2 细胞的培养与转染

乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞培养在含有10%FBS的DMEM高糖培养基中，置于5%CO2、37 ℃培养箱，每1至2天细胞换液或传代。取对数生长期的乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231接种于六孔板中，每孔细胞数为1×105，按照转染试剂盒指示，将miR-1247-3p的mimic、inhibitor、negative control(NC)或者 B4GALT3的siRNA与转染试剂混合，然后在不含胎牛血清的DMEM培养基中与MCF7和MDA-MB-231共孵育8h，再用完全培养基培养24 h。

1.3 乳腺癌细胞中RNA的提取

培养乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞至密度为80%，消化细胞至离心管中，加入Trizol裂解5 min，取上述细胞裂解液加入200 μl氯仿，静置5 min后，于12 000×g，4 ℃离心15 min，转移上层水相，加入500 μl异丙醇，12 000×g，4 ℃离心10 min，去上清，1 ml 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μl RNA-free水重悬RNA沉淀，55 ℃水浴10 min，即为总RNA，使用核酸定量仪检测总RNA含量。

1.4 RT-qPCR检测乳腺癌细胞中miR-1247-3p的表达水平

根据miRNA cDNA Synthesis 试剂盒指示配置反应体系，将提取的乳腺癌细胞RNA逆转为cDNA，然后利用核酸定量仪对cDNA进行定量。然后根据EvaGreen miRNA qPCR试剂盒指示配置反应体系，进行qPCR反应，采用GAPDH作为内参，反应后采用2-ΔΔCt法计算miR-1247-3p的表达量。

1.5 细胞增殖实验

消化转染后的乳腺癌细胞，稀释细胞至50000个/ml，将上述细胞接种至96孔板，每孔100 μl，每组三个复孔，并将细胞培养2～4 h，使乳腺癌细胞完全贴壁，然后每孔加入10 μl的CCK8溶液，继续37 ℃培养，分别于24 h、48 h、72 h用酶标仪检测各孔450 nm处的吸光度，OD值越大，细胞增殖能力越强。

1.6 细胞划痕实验

消化转染后的乳腺癌细胞，稀释细胞至300000个/ml，然后将各组细胞分别接种至96孔板，每孔30000个细胞，每组3个复孔，培养至细胞完全贴壁，然后用无菌的白色枪头在96孔板的中央轻轻划痕，划痕后立即用PBS清洗细胞，并在每孔加入无血清的DMEM培养基，显微镜下观察并拍照，然后放入培养箱中继续培养，于24 h后观察并拍照，计算划痕愈合率，划痕愈合率越高，细胞迁移能力越强。

1.7 细胞侵袭实验

4 ℃融化Matrigel胶，每个Transwell小室加入100 μl Matrigel胶，轻轻摇晃使胶在小室底部覆盖均匀，37 ℃培养箱中放置30 min，使Matrigel胶充分凝固。用不含血清的DMEM培养基重悬转染后的乳腺癌细胞，并稀释细胞至5000个/200 μl，并取200 μl细胞接种至Transwell小室中，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl完全培养基，使小室底部浸入培养基，将24孔板于培养箱中培养24 h后，取出小室用PBS清洗，小室底部用无水乙醇固定30 min，晾干后用结晶紫对小室底部染色10 min，清洗晾干后，在显微镜下观察拍照，每孔拍5张照片，并用Photoshop软件计数，比较各组侵袭的细胞数目，细胞数目越多，细胞侵袭能力越强。

1.8 miR-1247-3p靶基因的预测

在miRDB和microT-CD两个数据库中分别查找miR-1247-3p的靶基因，取两个数据库中的靶基因的交集，并使用Targetscan软件根据数据库提供的信息对靶基因进行置信水平分析，取置信水平最高的靶基因。

1.9 荧光素酶报告实验验证靶基因

采用荧光素酶报告实验鉴定预测到的靶基因和miR-1247-3p的靶向关系，具体步骤为：设计pGL3质粒载体，将靶基因构建在荧光素酶基因的前边，将空白pGL3质粒(pGL3-Control)、含靶基因pGL3质粒(pGL3-B4GALT3 WT)、以及阴性对照pGL3质粒(pGL3-B4GALT3 MUT)(质粒的设计和构建由广州博瑞生物有限公司完成)转染进入293T细胞，并且将miR-1247-3p的mimic及NC转染至上述293T细胞，培养24 h后，使用Dual Luciferase 试剂盒检测荧光强度，若miR-1247-3p能够与靶基因结合，则抑制下游荧光素酶的表达，荧光强度降低。

1.10 Western blot检测乳腺癌细胞中B4GALT3表达水平

取各组转染miR-1247-3p mimic、inhibitor、NC后的乳腺癌细胞加入1 ml的Trizol研磨均匀，加入1.5 ml的异丙醇，12 000×g，4 ℃离心10 min，去上清，用蛋白清洗液清洗3次后，用1%的SDS溶液重悬沉淀，即为总蛋白。BCA蛋白定量后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶对PVDF膜封闭2 h，然后以稀释后的GAPDH、B4GALT3一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL试剂盒说明书配置发光液，并将PVDF膜浸入发光液中反应半分钟，曝光并拍照，用Image J软件曝光结果进行定量分析。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 qPCR检测乳腺癌细胞miR-1247-3p的表达水平

根据qPCR检测结果(图1)：miR-1247-3p在乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的表达量显著高于乳腺上皮细胞中的表达量(P<0.001)，提示乳腺癌细胞或可通过高表达miR-1247-3p而促进其自身的生长。

图1 qPCR检测miR-1247-3p在乳腺癌细胞及乳腺上皮细胞中的表达水平

2.2 miR-1247-3p促进乳腺癌细胞的增殖能力

如图2所示：转染miR-1247-3p mimic的乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的OD值显著高于对照组，而转染miR-1247-3p inhibitor的乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的OD值显著低于对照组，提示miR-1247-3p表达上调可显著提高乳腺癌细胞的体外增殖能力。

2.3 miR-1247-3p促进乳腺癌细胞迁移能力

细胞划痕检测乳腺癌细胞迁移能力结果(图3)显示，转染miR-1247-3p mimic后MCF7和MDA-MB-231的划痕愈合率显著提高(P<0.001)；转染miR-1247-3p inhibitor后MCF7和MDA-MB-231的划痕愈合率显著降低(P<0.001)，提示miR-1247-3p能够在体外显著提高乳腺癌细胞的迁移能力。

2.4 miR-1247-3p促进乳腺癌细胞侵袭能力

细胞侵袭检测结果(图4)显示：相比于NC组，miR-1247-3p mimic组细胞数目显著增加(P<0.001)，而inhibitor组则显著减少(P<0.001)，提示miR-1247-3p能够显著促进乳腺癌细胞的侵袭能力。

2.5 miR-1247-3p靶基因预测结果

根据miRDB和microT-CD数据库筛选并评价miR-1247-3p靶基因结果，选取置信度最高的B4GALT3，并且预测到 miR-1247-3p与B4GALT3mRNA的结合区域。

2.6 荧光素酶报告实验验证靶基因结果

荧光素酶报告实验结果(图5)显示：miR-1247-3p mimic能够使pGL3-B4GALT3 WT组荧光强度显著下降(P<0.001)，而pGL3-Control组和pGL3-B4GALT3 MUT组荧光强度无显著变化，说明B4GALT3为miR-1247-3p的靶基因。

2.7 miR-1247-3p抑制乳腺癌细胞B4GALT3表达水平

Western blot结果(图6)显示：相比于NC组，转染miR-1247-3p mimic的MCF7和MDA-MB-231细胞B4GALT3表达显著降低(P<0.001)；而 miR-1247-3p inhibitor组表达显著升高(P<0.001)；说明miR-1247-3p能够显著抑制乳腺癌细胞B4GALT3表达水平。

2.8 下调B4GALT3促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力

如图7、8、9所示，当转染siRNA抑制B4GALT3表达时，乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的增殖能力显著上升；细胞划痕愈合能力显著上升；细胞侵袭数目亦显著上升；说明B4GALT3表达量下调能够促进乳腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力；而miR-1247-3p能够显著下调B4GALT3的表达水平，提示miR1247-3p能够通过下调其靶基因B4GALT3的表达而促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的能力。

图2 CCK8检测MCF7和MDA-MB-231增殖能力

图3 细胞划痕检测MCF7和MDA-MB-231迁移能力

图4 细胞侵袭能力检测结果

图5 荧光素酶报告实验预测靶基因结果

3 讨论

乳腺癌作为1种高发于女性的癌症，是女性癌症死亡的第二大原因，预后较差，平均5年的生存率仅为27%[5-7]；临床上的化疗、放疗等治疗虽然可以控制肿瘤的原位生长[8]，但是对肿瘤的转移的治疗效果并不显著，尤其时在预防和防止复发方面更是存在巨大的挑战，因此寻找到新的参与乳腺癌发生和发展的生物标志物，为临床的诊断和治疗提供新的思路至关重要。miRNA是一类内源性的[9]，由20～24个核苷酸组成的非编码RNA，其作用机制主要是通过结合mRNA3'-UTR而抑制靶基因的表达[10]，在基因的表达中起到负调控的作用，且人类基因组中约1/3的编码基因受miRNA的调控[11]，近年来逐渐有研究表明，肿瘤组织中miRNA的差异表达是造成肿瘤发展的重要原因[12]；而在本研究发现miR-1247-3p在乳腺癌细胞中显著高表达，提示miR-1247-3p可能在肿瘤的生长和转移中发挥作用。

本研究通过CCK8法检测乳腺癌细胞的增殖能力，发现过表达miR-1247-3p能够显著提高乳腺癌细胞的增殖能力，低表达miR-1247-3p则抑制；通过细胞划痕实验评价乳腺癌细胞的体外迁移能力，发现过表达miR-1247-3p乳腺癌细胞的迁移能力显著提高；并且通过细胞侵袭实验也发现过表达miR-1247-3p促进乳腺癌细胞的侵袭能力。

为进一步探究miR-1247-3p促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制，本研究通过生物信息学的预测并通过荧光素酶实验验证其靶基因为B4GALT3，且Western blot检测结果表明过表达miR-1247-3p能够抑制B4GALT3的表达；目前，B4GALT3已经被报道在肝癌中发挥促癌作用[13]，但其在乳腺癌中的作用尚未有详细报道，而本研究首次发现抑制B4GALT3的表达能够促进乳腺癌细胞增殖、迁移以及侵袭的能力。

图6 Western blot检测B4GALT3表达水平

图7 下调B4GALT3促进乳腺癌细胞的增殖

图8 下调B4GALT3促进乳腺癌细胞划痕愈合

图9 下调B4GALT3促进乳腺癌细胞的迁移能力

综上所述，miR-1247-3p可通过抑制B4GALT3的表达而促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，但是其下游的精细机制还需进一步探讨。