MEX3A在非小细胞肺癌中的表达与功能研究*

朱贝 郭小朋 董天祺 肖春杰

在过去30年间，中国肺癌相关死亡上升了4倍以上[1]，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌相关死亡约80%[2]。NSCLC的发生和发展通常与肿瘤相关基因的表达有关。因此，寻找NSCLC 新的分子生物学标志物并将其作为NSCLC诊断及治疗靶点至关重要。

MEX3A蛋白是一种RNA结合蛋白，其N端具有高度保守的KH结构域[3-4]，MEX3A通过KH结构域与mRNA，介导mRNA的翻译、监控和降解过程[5]，进而调节细胞的一系列功能。已有研究表明，MEX3A在膀胱癌、胃癌[6]、肾母细胞瘤[7]、膀胱尿路上皮癌[8]以及肝癌[9]中异常表达，但MEX3A 在NSCLC中的作用及功能却鲜有研究。据此，本文探究了MEX3A 在NSCLC 中的表达效果以及沉默MEX3A基因后对NSCLC发生和发展的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 转录组芯片分析及TCGA数据库数据分析 利用转录组芯片分析技术，对云南省肿瘤医院收集的15例宣威地区的肺癌样本（癌和癌旁组织）进行mRNA转录组芯片分析，通过芯片制备、杂交反应、信号检测、数据分析，筛选出差异基因。对来自癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中共226例肺腺癌样本与20例正常组织样本进行RNA序列分析。

1.1.2 细胞系与细胞培养 人NSCLC 细胞系A549、NCI-H292 及人正常的肺上皮细胞系BEAS-2B 均购自昆明动物研究所细胞中心，XWLC和GLC均受赠于云南省肿瘤医院。A549、NCI-H292和BEAS-2B细胞均在RPMI-1640 培养基（Hyclone，美国）中培养，XWLC和GLC 在DMEM 高糖培养基（Hyclone，美国）中培养，每种培养基中均添加10%胎牛血清（Hyclone，美国）、100 g/mL青霉素和100 g/mL链霉素（Hyclone，美国）。所有细胞均培养在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 选取MEX3A 高表达的A549和NCI-H292细胞系进行转染。细胞以5×104/孔接种于培养皿中，培养24 h 后，更换为不含抗生素的培养基，用脂质体RNAiMAX（Invitrogen，美国）将MEX3A的靶向抑制剂小干扰RNA（siMEX3A：5'-GCAAGAUCCUCGAGUACAATT-3'，上海吉玛公司）和阴性对照siRNA（siNC：5'-UUCUCUCUC CGAACGUGUCUCUCUGACGUTU TT-3'，上海吉玛公司）转染至细胞，转染后继续培养48 h以待分析。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR） 根据试剂盒说明，提取细胞总RNA并将其反转录为cDNA（PrimeScriptTMRT 反转录试剂盒，Takara，中国）。人GAPDH 用作内参基因，qRT-PCR 监测MEX3A 在BEAS-2B、NCI-H292、A549、XWLC和GLC 细胞中的表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3 细胞增殖试验 将3 000/孔细胞悬液接种在96孔板（Corning Costar，美国）中，设置3个复孔，分别在转染24、48和72 h后中加入10 μL CCK8试剂（Dojindo Laboratories，Kumamoto，日本），加入CCK8试剂2.5 h后，3 h内每隔30 min用多功能酶标仪测量细胞OD 450 nm处的吸光度。

1.2.4 Transwell 试验 在Transwell小室（Corning Costar，美国）中铺好10 μL的基质胶（25 mg/50 mL，BD Biosciences，美国），在无血清培养基培养细胞12 h，然后以30 000/孔将细胞接种到Transwell小室的上室中，下室用含20%胎牛血清的培养基作为诱导物，37℃培养48 h，去除培养基并用4%多聚甲醛（生工生物工程有限公司，上海）固定细胞，0.1%吉姆萨染液（北京索莱宝科技有限公司，北京）染色细胞。细胞迁移测定在相同条件下进行，上室不覆盖基质胶。最后所有细胞均于10×10倍显微镜下观察拍照。

1.2.5 细胞周期与凋亡试验 细胞周期试验：收集并纯化细胞，70%预冷的乙醇（生工生物工程有限公司，上海）固定细胞12 h，PBS 洗去乙醇，与核糖核酸酶A（10 mg/mL，BD Biosciences，美国）37℃反应30 min，碘化丙啶（10 μg/mL，BD Biosciences，美国）避光染色30 min。流式细胞仪（BD Biosciences，美国）分析细胞周期，采用FlowJo 7.61软件评估G0-G1、S和G2-M期细胞的百分比。

细胞凋亡试验：用不含EDTA的胰酶消化细胞，无双抗的培养基终止消化，收集并重悬细胞，分别加5 μL碘化丙啶和5 μL Annexin V-FITC染液（细胞凋亡试剂盒，BD Biosciences，美国）避光染色20 min。流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。t检验用于比较组间差异。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MEX3A在NSCLC中高表达

本研究对在云南省肿瘤医院收集的15例宣威地区肺癌样本（癌和癌旁组织）进行mRNA 转录组芯片分析（表2），共筛选出2 724个差异表达的基因，606个基因的mRNA表达水平显著上调，2 118个基因的mRNA表达水平显著下调。表达上调的基因中，MEX3A、ARHGAP40、GPR110、FLJ13744、PSAT1、B3GNT6、FUT2、MND1、CXCL13、MUC21 上调倍数均高于6倍（P＜0.05，表3）。通过筛查基因背景后，选择表达效果明显的MEX3A基因（P＜0.01，表3）作为研究对象。对TCGA数据库数据进行统计分析显示，与正常组织（n=20）相比，MEX3A mRNA 在肺腺癌组织（n=226）中显著高表达（P＜0.001，图1A）。

qRT-PCR结果显示，与癌旁细胞系BEAS-2B 相比，A549、NCI-H292 细胞系中MEX3A mRNA表达水平显著高于BEAS-2B（P＜0.001，图1B）。此外，qRTPCR结果显示沉默MEX3A（siMEX3A）后，A549和NCI-H292的MEX3A的mRNA表达水平显著降低（P＜0.001，图1C）。

表2 新鲜组织样本临床病理资料

表3 mRNA转录组芯片筛选出在NSCLC中上调的mRNAs

图1 MEX3A在NSCLC中高表达

2.2 沉默MEX3A对NSCLC增殖的影响

CCK8试验结果显示，与阴性对照组（siNC）相比，沉默MEX3A后，A549和NCI-H292的增殖能力均被显著抑制（P＜0.05，图2）。

2.3 沉默MEX3A对NSCLC侵袭及迁移的影响

Transwell试验结果显示，与阴性对照组相比，沉默MEX3A后A549和NCI-H292细胞的侵袭（P＜0.001）及迁移（P＜0.001）能力均明显减弱（图3）。

2.4 沉默MEX3A对NSCLC凋亡的影响

流式细胞试验结果显示，MEX3A被沉默后促进A549（P＜0.05）和NCI-H292（P＜0.001）的凋亡（图4）。

2.5 沉默MEX3A对NSCLC周期的影响

流式细胞试验结果显示，沉默MEX3A后A549及NCI-H292中G2/M期细胞明显增多，细胞周期均被阻滞于G2/M期（P＜0.001，图5）。

图2 沉默MEX3A基因后抑制NSCLC的增殖

图3 沉默MEX3A基因后抑制NSCLC的侵袭及迁移

图4 沉默MEX3A基因后诱导NSCLC细胞凋亡

图5 沉默MEX3A基因后阻滞NSCLC细胞周期

3 讨论

NSCLC的靶向治疗已取得突破性进展[10]，但由于诊断和治疗方法有限，导致NSCLC患者的生存和预后仍不理想。遗传因素是引起NSCLC的主要原因，研究表明，超过40%NSCLC是由未知基因异常表达引起的[11]。因此，找到NSCLC的相关生物标志物，并了解其致癌机制，对NSCLC的早期诊断和寻找治疗靶点极为重要。

MEX3是在秀丽隐杆线虫中发现的一类翻译调节蛋白，该蛋白能抑制蛋白翻译过程[12]。MEX3 包含MEX3A、MEX3B、MEX3C、MEX3D基因[3]，已有研究表明，MEX3蛋白的相关基因异常表达会引起胚胎死亡[12]。其中MEX3A与MEX3B是P小体的组成部分，P小体可浓缩细胞质中的酶，进而参与mRNA的调控过程[13-14]。现已有证据表明MEX3A可通过介导mRNA的代谢过程，参与细胞的生命进程。MEX3A基因的异常表达会引起癌症等多种疾病，有研究发现，MEX3A是肾母细胞瘤潜在的致癌基因[7]，但MEX3A在NSCLC中的表达效果及其相关功能却鲜见研究。因此，本文对MEX3A在NSCLC中的表达与功能进行探索。首先，通过转录组芯片分析筛选出在NSCLC中表达上调最显著的MEX3A基因。为探索MEX3A基因在NSCLC中的表达水平，对TCGA数据库中226例肺腺癌样本和20例正常样本进行分析，发现MEX3A mRNA在肺腺癌组织（n=226）中显著高表达（P＜0.001），与此同时qRT-PCR的结果也显示MEX3A mRNA在NSCLC细胞系A549和NCI-H292中表达显著升高（P＜0.001）。以上结果均表明MEX3A在NSCLC中显著高表达。

已有研究发现，RNA干扰技术沉默MEX3A基因后膀胱癌细胞的增殖能力受到明显抑制，且凋亡效率明显增加[15-16]，Shi等[8]也发现MEX3A能促进乳头状膀胱尿路上皮癌细胞的增殖和迁移，但却鲜有MEX3A 对NSCLC影响的相关研究。因此，为进一步探索MEX3A在NSCLC中的功能，本研究通过RNA干扰技术沉默A549和NCI-H292的MEX3A基因，结果提示沉默MEX3A后NSCLC的增殖（P＜0.05）、侵袭（P＜0.001）及迁移（P＜0.001）能力均明显减弱，提示MEX3A可能作为NSCLC的异常基因导致NSCLC 异常增殖并失去接触抑制，而沉默MEX3A基因能降低上述异常功能。

细胞的增殖和凋亡与细胞周期调控有关，细胞周期调控异常会导致细胞增殖及凋亡异常，进而引发肿瘤。G2/M期是DNA损伤修复的重要时期，G2/M期被阻滞使DNA 损伤无法被修复而走向凋亡。研究发现，MEX3A基因在胃癌细胞中高表达，主要在胃癌细胞的G2/M期发挥作用从而促进胃癌细胞的增殖与侵袭，而沉默MEX3A能有效抑制该过程[6]，亦有研究表明MEX3A可以影响肠细胞的分化和细胞周期进程[17]。但目前尚缺乏关于MEX3A对NSCLC细胞凋亡和周期的影响的相关报道，本研究发现沉默MEX3A基因后A549和NCIH292细胞被明显阻滞于G2/M期（P＜0.001），A549和NCIH292 细胞凋亡显著上升（P＜0.05）。结果提示沉默MEX3A基因可导致NSCLC被阻滞于G2/M期，并最终诱导NSCLC凋亡。

综上所述，MEX3A可能作为促癌基因参与了NSCLC细胞的生长和增殖过程，而沉默MEX3A能降低该过程。该研究为继续探究MEX3A的相关作用机制奠定了基础，提示MEX3A或许可作为NSCLC诊断和治疗的标志物，为攻克NSCLC提供新的靶点。