藤三七多糖的体外抗氧化活性研究

柳 杨 赵红喜

藤三七又名洋落葵，是落葵科落葵属蔓生植物[1]，具有滋补强壮、活血化瘀、通脉止痛、调脂降压等功效，常用于治疗腰膝痛、风湿痛、骨折、血虚血滞等症[2]。藤三七所含化学成分包括拉里亚苷元、黄酮类、多糖、尿嘧啶及腺苷等化合物[3，4]。近年来，对多糖的活性研究表明，其中部分多糖对多种活性氧具有清除功效。据文献报道，落葵多糖具有较强的抗氧化活性[5]，藤三七作为落葵科植物其多糖是否亦具有抗氧化活性值得探讨。因此本研究通过对藤三七多糖的体外抗氧化活性进行探讨，以期对其临床应用起到参考作用。

1 仪器与材料

AGBP210S 电子天平(Satorius公司)；AB135S分析天平(Mettlertoledo仪器上海有限公司)；UV-2501PC 紫外分光光度计(日本岛津)；HS-25数显pH计(上海精密仪器科学有限公司)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DILW型电子恒温水浴锅(北京永光明医疗仪器厂)。

邻二氮菲、FeSO4、H2O2、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、EDTA均为分析纯，水为去离子水。

藤三七购自沁春源绿色保健蔬菜种苗开发研究中心，由沈阳药科大学贾英教授鉴定为正品。

2 藤三七多糖的提取

取藤三七药材约10 g，加入石油醚回流提取2次，每次2 h。弃去提取液，残渣用80 %乙醇100 ml回流提取2次，每次2 h。弃去提取液，残渣加蒸馏水回流，提取3次，每次2 h。合并提取液，浓缩至40 ml，用Sevage法除去蛋白。水层加入95 %乙醇，静置，离心弃去上清液，沉淀先后用无水乙醇、丙酮、无水乙醚多次洗涤，真空干燥，即得藤三七多糖。

3 藤三七多糖对·OH清除率的测定(H2O2/Fe2+体系法)

3.1 H2O2/Fe2+反应体系原理Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应,在H2O2/Fe2+体系法中通过Fenton反应，H2O2产生·OH，邻二氮菲-Fe2+被·OH氧化为邻二氮菲-Fe3+，其536 nm处吸收峰消失，因此测定536 nm处吸收值的变化可分析·OH的变化[6]。

3.2 溶液的配制多糖样品溶液的配制：取藤三七多糖4 mg，置于10 ml量瓶中，用水定容，备用。0.75 mmol·L-1邻二氮菲溶液的配制：取200 mg邻二氮菲，加无水乙醇溶解成20 ml，取此溶液3.75 ml，用蒸馏水稀释至250 ml，摇匀，即得。150 mmol·L-1pH值7.4 PBS溶液的配制甲液：取7.164 g Na2HPO4·12 H2O，加水溶解，并稀释至100 ml。乙液：取3.12 g NaH2PO4·2 H2O，加水溶解，并稀释至100 ml。取上述甲液81 ml与乙液19 ml混合，摇匀，稀释成150 ml，即得。

3.3 样品的测定将各多糖样品配成浓度为4 mg·ml-1的溶液。取6支试管，分别加入0.75 mmol·L-1邻二氮菲溶液1 ml，150 mmol·ml-1pH 7.4 PBS 1.5 ml，充分混匀后，加入0.75 mmol·L-1FeSO4溶液1 ml，每加1管立即混匀，然后向其中一管加入0.01% H2O21 ml(损伤)，另一管不加H2O2(未损伤)，以蒸馏水补充体积，37 ℃保温60 min后，以磷酸盐缓冲液为参比，分别测536 nm时吸收值，得A损伤与A未损伤。其余4管分别加入一定的其他多糖溶液，混匀，再分别加入0.01 %H2O21 ml，37 ℃保温60 min后以同浓度的多糖液作参比，测536 nm时的吸收值，即得A样。重复5次，用下式计算·OH清除率：·OH清除率(S%)=(A样-A损伤)/(A未损伤-A损伤)×100%

表1 样品和试剂的加入量

在上述条件下，藤三七多糖对·OH具有清除作用，且随着藤三七多糖的增加，清除率上升，存在一定的量效关系，最大清除率可达到43.83%。藤三七多糖对·OH清除率的结果见图1。

图1 藤三七多糖对·OH消除率

4 藤三七多糖对清除率的测定(邻苯三酚自氧化法)

4.2 邻苯三酚自氧化速率测定取4.5 ml pH 8.2 50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液，1.2 ml蒸馏水，混匀后加入25 ℃预热过的邻苯三酚0.3 ml(以10 mmol·L-1HCl配制，空白管用10 mmol·L-1HCl代替邻苯三酚的HCl溶液)，迅速摇匀，倒入比色杯，325 nm下每隔30 s测定吸光度，计算每分钟吸光度的增加△A0。

表2 样品和试剂的加入量

4.3 样品的测定取藤三七多糖4 mg，精密称定，以蒸馏水溶解定容至10 ml量瓶中，在加入邻苯三酚前，先加入一定体积的多糖溶液，蒸馏水减少，然后按下述方法计算清除率。清除率(%)=(△Ao―△A)/(△Ao)×100%。其中：△Ao为邻苯三酚自氧化速率，△A为加入多糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率。

表3 样品和试剂的加入量

图2 藤三七多糖对的清除率

5 讨论

本研究证明藤三七多糖在一定的浓度范围内，对羟自由基有较好的清除作用，多糖浓度越大，清除作用越强，呈明显量效关系；对超氧阴离子自由基也有清除作用，且亦呈明显量效关系。

邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，并产生超氧阴离子，加速邻苯三酚的自氧化速率，同时产生有色中间产物，根据邻苯三酚自氧化速率测定方法，采用紫外分光光度计在190～700 nm范围内进行全波长扫描，结果表明325 nm处有强烈吸收，变化显著，并且样品无干扰，因此检测波长设定为325 nm。