骨折挫伤胶囊质量评价

孔令锋，王铁军，郭汉文，李成森，孙苓苓，王欢

(1.辽宁省药品检验检测院，辽宁 沈阳 110036； 2.丹东市药品检验检测中心，辽宁 丹东 118000；3.山东泓润健康科技有限公司，山东 济南 250022)

骨折挫伤胶囊收载于《中国药典》2015年版(一部)，该处方主要由猪骨(制)、黄瓜子(炒)、土鳖虫、自然铜(煅)、乳香(制)、没药(制)、血竭、红花、大黄、当归组成。具有舒筋活络，消肿散瘀，接骨止痛之功效。其疗效确切，为跌打损伤首选药物之一[1-3]，该品种为2016年国家评价性抽验品种，全国共有生产企业13家，批准文号13个。

本次共抽取112批次样品，涉及生产企业8家、批准文号8个，按国评工作方案，进行了法定标准检验。基于法定检验结果，以问题为导向，结合该品种处方含贵细药、矿物药、动物药等特点，参考相关文献[4-10]从药品安全性、有效性、稳定性方面进行了探索性研究，综合法定标准检验与探索性研究的结果，对骨折挫伤胶囊质量情况进行评价，为药品监管及质量标准提升提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent Technologies 1260series高效液相色谱仪，包括G1311C四元梯度泵，G1329B自动进样器，G4212B二极管阵列检测器，Agilent Ezchromn色谱工作站；HU10260B型超声波清洗器；Sartorius CP225D电子天平；普析通用TU-1950型紫外可见分光光度计；PerkinElmer PinAAcle 900T原子吸收光谱仪；CEM-MARS 微波消解仪。

1.2 试药 血竭素高氯酸盐对照品(批号：110811-201506，纯度98.6%)、羟基红花黄色素A对照品(批号：111637-201106，纯度92.5%)、大黄酚对照品(批号：110796-201319，纯度99.6%)、11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品(批号：111760-201502，纯度99.3%)均购自中国食品药品检定研究院；铅元素标准溶液(批号：GSB 04-1742-2004)、镉元素标准溶液(批号：GSB 04-1721-2004)、砷元素标准溶液(批号：GSB 04-1714-2004)、汞元素标准溶液(批号：GSB 04-1729-2004)、铜元素标准溶液(批号：GSB 04-1725-2004)均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心，乙醇、乙腈为色谱纯，硝酸及盐酸为优级纯，水为重蒸水。骨折挫伤胶囊共112批次，均来自国家评价性抽样样品，共8家生产企业(A～H)。

2 法定标准检验

2.1 标准检验结果 骨折挫伤胶囊质量标准为《中国药典》2015年版(一部)，检验项目包括性状、显微鉴别、大黄和红花的薄层鉴别、常规检查项和血竭素HPLC含量测定。对112批样品按法定标准检验均符合规定，合格率100%。

2.2 标准评价 对骨折挫伤胶囊现行标准进行分析， 认为现行标准设置不够全面，因血竭素高氯酸盐稳定性差，现行标准限度值有待商榷，未对红花、大黄、乳香等药材进行控制，导致必要的检验项目缺失。该品种为生药原粉制剂，可能存在染色、掺伪、重金属超标等隐患，无法对产品的安全性、有效性进行控制。

3 探索性研究

从药品安全性、有效性、稳定性等方面对65批样品(去除重复批号后)进行探索性研究，达到全面评价该品种整体质量的目的。

3.1 药品安全性研究

3.1.1 非法染色 骨折挫伤胶囊为全原粉制剂，处方中有红花、血竭药材，针对可能存在的掺伪染色问题，采用薄层色谱方法对苏丹Ⅰ、苏丹Ⅳ、808猩红、酸性红73、金橙Ⅱ、柠檬黄、胭脂红、金胺、新品红、赤藓红等10种色素进行了筛查，结果65批样品均未发现染色问题。

3.1.2 松香酸掺伪 骨折挫伤胶囊处方中含有醋乳香、醋没药、血竭三味树脂类药材，针对可能存在松香掺伪问题，采用HPLC法对松香酸进行筛查，结果65批样品均未检出松香酸。

3.1.3 重金属检测 骨折挫伤胶囊处方中含有矿物药自然铜，可能产生内源性的重金属积蓄，处方中的土鳖虫，也容易导致重金属超标。因此采用仿人工胃液对制剂进行样品前处理 ,用ICP-MS法测定20批样品中铅、镉、砷、汞、铜含量。参照WHO推荐的每日最高摄入量限度(以体重60 kg计)，铅为214 μg、镉为60 μg、砷为128 μg、汞为43 μg、铜为30 mg。按每日服用量折算各元素值，铅(Pb)的每日最大摄入量为65 μg，镉(Cd)的每日最大摄入量为1.45 μg，砷(As)的每日最大摄入量为34 μg，汞(Hg)的每日最大摄入量为8 μg，合格率45%，铜(Cu)的每日最大摄入量为0.2 mg，均未超出WHO的推荐值。

3.2 药物有效性研究

3.2.1 当归的薄层色谱鉴别 参考《中国药典》2015年版(一部)中当归的薄层鉴别方法并进行优化，建立骨折挫伤胶囊中当归的薄层鉴别方法。对65批样品进行检测，结果63批样品可清晰检出当归，2批样品未检出当归，涉嫌所用药材质量较差或制剂工艺可能存在问题。典型色谱图见图1。

3.2.2 血竭、乳香的薄层色谱鉴别 参考《中国药典》2015年版(一部)中血竭、乳香及天麻头痛片的薄层鉴别方法，以血竭对照药材、乳香对照药材做对照，对处方中的血竭、乳香进行共薄层鉴别。结果65批样品均可清晰检出血竭、乳香，合格率100%。典型色谱图见图2。

在农业科技飞速发展的大背景下，玉米种植实现全程机械化生产已经成为农业领域中的又一重要课题。我单位是云南省陆良县召夸镇农业综合服务中心，在当地玉米全程机械化方面进行了积极尝试，为地区现代农业化发展做出了突出贡献。但“发展始终在路上”，陆良县玉米全程机械化仍存在一些实际困难，针对这一情况提出了几点解决建议，希望能够给广大同行以有益的启示。

3.2.3 红花、大黄的含量测定 现行标准仅有血竭素含量测定项，无法有效控制制剂的整体质量。探索性研究建立了同时测定红花、大黄含量的HPLC方法，对8个企业的65批样品进行检测。结果不同生产企业的各有效成分含量差异较大，同一生产企业不同批次之间各有效成分含量差异明显。

3.2.3.1 色谱条件 色谱柱： Agilent Zorbax Bonus-RP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～13 min，18%A→25%A；13～14 min，25%A→80%A；14～25 min，80%A)；流速1.0 mL·min-1；羟基红花黄色素A和大黄酚检测波长为428 nm；柱温为35 ℃；进样量10 μL。

3.2.3.2 溶液的制备 混合对照品溶液 取羟基红花黄色素A对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加乙醇制成混合对照品储备液Ⅰ，每1 mL含羟基红花黄色素A 29.82 μg、大黄酚5.214 μg，精密量取对照品储备液Ⅰ 5 mL置25 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，得混合对照品溶液Ⅱ，每1 mL含羟基红花黄色素A 5.964 μg、大黄酚1.043 μg，备用。

3.2.3.3 供试品溶液 取骨折挫伤胶囊10粒的内容物0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定重量，超声处理(功率200 W，频率50 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

3.2.3.4 系统适用性试验 精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，进样分析，结果各待测成分与前后峰分离良好，分离度均大于1.5；理论板数以羟基红花黄色素A、大黄酚峰计算均不低于4 000。

3.2.3.5 线性关系考察 分别精密吸取羟基红花黄色素A、大黄酚混合对照品溶液及储备液注入液相色谱仪，测定，以对照品的进样量(X，μg)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果表明，在线性范围内上述3种有效成分的进样量与峰面积呈良好的线性关系。详见表1。

表1 骨折挫伤胶囊中3种成分的回归方程和线性范围

3.2.3.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液Ⅱ 10 μL，进样分析，连续进样6次，测定2种成分的色谱峰面积，结果羟基红花黄色素A、大黄酚峰面积的RSD值分别为0.1%、0.8%(n=6)。结果表明仪器精密度良好。

3.2.3.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(企业B，批号：160301)10 μL，分别于配制后0、2、4、8、12、18和24 h进样测定。结果羟基红花黄色素A、大黄酚峰面积的RSD值分别为0.3%、0.5%(n=6)，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.2.3.8 重复性试验 精密称取同一批号的样品(企业B，批号：160301)6份，各0.2 g，分别制成供试品溶液，按相应色谱条件测定。结果羟基红花黄色素A、大黄酚的含量平均值分别为1.138 6、0.250 6 mg·g-1，RSD分别为0.9%、0.4%(n=6)，表明重复性良好。

3.2.3.9 回收率试验 精密称取已知含量的样品(企业B，批号：160301)0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入羟基红花黄色素A、大黄酚合对照品溶液I 10 mL，制备回收率样品溶液，进样分析，分别计算各成分的回收率及RSD值，羟基红花黄色素A、大黄酚的平均加样回收率分别为99.7%、98.7%，RSD分别为0.2%、0.8%(n=6)。

3.2.3.10 样品测定 取8家生产厂家共65批样品，制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算样品中羟基红花黄色素A、大黄酚的含量，结果见表2。

表2 各生产厂家样品测定结果统计

企业B生产的骨折挫伤胶囊中羟基红花黄色素A和大黄酚的平均含量最高，且2种成分含量结果的分布均一性较好；企业A、E、G的样品中部分成分平均含量较高，但含量结果的分布离散性较大，提示其生产原料或生产工艺稳定性较差；企业C、F、H的样品批数较少，数据量较少，趋势不明。

3.3 药物稳定性研究

3.3.1 血竭素含量测定分析 现行标准规定血竭素的含量不得少于40 μg/粒，对批次在6批以上的企业生产的产品进行统计分析，由图4可见，各企业产品血竭素含量差异较大，同一企业生产日期较早的产品含量较低，对企业的函调也反馈血竭素含量不稳定，随贮存时间延长血竭素含量出现明显的下降趋势，降解快，部分批次样品测定结果接近限度值。测定方法重现性不好，存在标准不完善的问题。针对这一问题分析血竭素的结构特点，发现血竭素属于花青素类化合物(flavylium compounds)，其和报道过的花青素相类似，在溶液中不稳定，随着温度、光照及溶液pH值的变化，发生一系列可逆复杂的结构转变[11-20]，因此根据制剂特点分别考察了提取溶液pH值、混料顺序等因素对血竭素稳定性的影响。

3.3.2 提取溶液pH值的影响 分别配制不同浓度的磷酸甲醇溶液作为提取溶剂，并按照现行标准含量测定方法制备骨折挫伤胶囊供试品溶液，测定血竭素的含量，结果见图5。由图可见，供试品提取溶剂pH值越低，血竭素的含量测定结果的数值越大。

3.3.3 混料顺序对血竭含量测定的影响 除猪骨胶外，处方中的其他9味药材均为原粉入药，处方中含有大量动物胶质类、脂肪类、蛋白质类、树脂类等成分，考虑到处方药味之间可能存在一定的相互影响作用，故分别考察血竭单独混合粉碎和与各药味分别粉碎对血竭含量测定结果的影响。

按处方量，分别取血竭与处方中任一味药粉碎后，再与其他8味药的混合细粉混匀。分别于血竭混合粉碎药味顺序为猪骨胶(A1)、炒黄瓜子(A2)、醋乳香与醋没药(A3)、当归(A4)、红花(A5)、土鳖虫(A6)、煅自然铜(A7)、大黄混合后粉碎成细粉(A9)，另取血竭单独粉碎后，再与其他9味药的混合细粉混匀(A8-1和A8-2)。按照现行执行标准《中国药典》2015年版(一部)“骨折挫伤胶囊”【含量测定】项方法，分别测定血竭素含量，结果见图6。

由图可见，猪骨胶、当归、红花、煅自然铜与血竭混粉对血竭素的含量测定结果影响较小；醋乳香、醋没药与血竭混粉和土鳖虫与血竭混粉对血竭素的含量测定结果影响较大；血竭单粉后，测定前与其他药味混合，含量测定结果的数值最高。分析原因：①醋乳香、醋没药与血竭均为树脂类药材，在粉碎过程中可能产生互相包裹，影响提取效率；②考虑到各药味在处方中的占比，土鳖虫对含量测定结果影响最大，这可能与不法商家为给土鳖虫增重，喂食生石灰、水泥等碱性物质有关，血竭素在碱性作用下会产生化学结构变化，最终导致含量测定结果数值大幅下降。因此建议企业在制剂过程中血竭药材采用单独粉碎后再与其他药味混料。

4 总结与讨论

根据法定标准检验和探索性研究结果，对骨折挫伤胶囊进行较为全面的分析，从药品安全性、有效性、稳定性方面进行研究，建立相关方法进行评价，整体评价骨折挫伤胶囊质量较好，但存在检测指标稳定性差、限度值有待商榷、同一企业批间差异较大、不同企业一致性不佳等问题。

针对发现的问题，提出以下建议：①加强生产全链条控制，严把药材质量，对生产工艺进行进一步优化，对上市后产品稳定性进行深入研究；②进行标准提升，增加必要的安全性、有效性检验项目，加强产品整体质量控制，确保产品质量。