玉屏风颗粒抑制鼻咽癌作用实验研究

罗阳旭，蔡璐，郭静，马安德，罗奇志

(1.南方医科大学公共卫生学院卫生检测中心，广东 广州 510515；2.南方医科大学肿瘤研究所，广东 广州 510515；3.广东环球制药有限公司，广东 佛山 528303；4.南方医科大学法医学院法医毒物学系，广东 广州 510515)

鼻咽癌是发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，高发于中国南方，具有明显的种族和地区分布特征[1]。由于其发病部位隐蔽，早期不易被发现，临床上患者就诊时多出现如颈部淋巴结肿大、头痛、耳鸣和复视等转移症状和体征，失去了最佳治疗时机[2]。研究表明，鼻咽癌的发病与环境污染、遗传因素及爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染密切相关[3]。临床上治疗主要为放疗原发灶，并辅以铂类药物为主的化疗，早期的治疗效果较好，5年生存率在50%～70%之间，但中晚期效果不理想，5年生存率仅为10%～40%，患者死亡的原因主要是癌细胞全身多处转移，包括淋巴转移、骨转移等[4]。中医学认为鼻咽癌的发病与先天不足、外邪入侵及七情所伤所致的正气亏虚、脏腑功能低下和气滞血瘀痰凝等有关[5]。在临床应用中，中医药除了配合放化疗增敏减毒外，在鼻咽癌患者的治疗过程中也显示出了提高生存率和改善生活质量的作用[6-7]。

玉屏风颗粒由黄芪、防风、白术(炒)三味中药组成，处方出自元朝朱丹溪的《丹溪心法》，是中医扶正固本的经典方剂，具有益气健脾、固表止汗的功效[8]。有研究报道表明，玉屏风方剂能提高肿瘤患者机体免疫，改善患者生存质量[9]。因此，本研究通过体外细胞实验和人癌异体移植瘤模型考察玉屏风颗粒对鼻咽癌的作用，为玉屏风颗粒在抗肿瘤治疗中的应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 细胞株与实验动物 人鼻咽癌CNE-2细胞株，由南方医科大学肿瘤研究所传代培养并保存。SPF级Balb/C裸鼠32只，3～4周龄，雌性，购自广东省医学实验动物中心[实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002]。本实验经过南方医科大学伦理委员会批准，实验动物饲养在南方医科大学实验动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2016-0167]SPF级动物房。饲养温度为22～26 ℃，湿度为40%～70%，采用12 h∶12 h昼夜循环照明。动物能够自由进食和饮水，动物在新环境适应性喂养1周后开始实验，实验过程中采取适当措施来减少实验动物数量和减轻动物所受伤害。

1.2 主要药品与试剂 玉屏风颗粒(国药准字 Z10930036，广东环球制药有限公司)；顺铂(批号：908027CF，齐鲁制药有限公司)；RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰酶(0.25%)和噻唑蓝(MTT)(Gibco，美国Thermo Fisher Scientific公司)；二甲基亚砜(DMSO，德国Sigma-Aldrich公司，北京鼎国昌盛生物技术有限公司分装)。

1.3 主要仪器 超净工作台(上海博讯生物仪器股份有限公司)；Forma series Ⅱ型CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司；Eclipse Ti倒置显微镜(日本Nikon公司)；冷冻高速离心机(德国Sigma-Aldrich公司)；Forma超低温冰箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；高压蒸汽灭菌器(日本Hirayama公司)；Millipore纯水仪(德国Merck公司)。

2 实验方法

2.1 人鼻咽癌CNE-2细胞实验 MTT粉末避光用PBS溶解，配成5 mg·mL-1浓度，0.22 μm滤膜除菌分装，-20 ℃保存备用。称取玉屏风颗粒10 g，溶于50 mL蒸馏水中，超声提取30 min，取上清液高压灭菌，按1∶4的比例进行倍比稀释，配成梯度浓度，用于细胞实验。

人鼻咽癌CNE-2细胞常规传代培养，取对数生长期细胞用胰酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液制成细胞悬液，以3×104个/mL的细胞密度加入96孔板中，每孔200 μL，37 ℃，5% CO2孵箱中培养24 h，待细胞长成单层，吸出培养液，加入梯度浓度的玉屏风颗粒药液，每个浓度5个复孔。对照组加入等体积含2%胎牛血清的RPMI-1640培养液，并设调零孔。37 ℃，5% CO2孵箱中培养72 h后，将药液吸出，每孔加入5 mg·mL-1MTT 200 μL，37 ℃，5% CO2孵箱中孵育4 h，弃上清，每孔加入DMSO 200 μL，室温下震荡混匀10 min，使用酶标仪测定吸光度，检测波长为490 nm。并按下列公式计算细胞存活率，绘制细胞存活率-药物浓度曲线。

细胞存活率=(药物组平均吸光度值)/(对照组平均吸光度值)×100%

2.2 鼻咽癌CNE-2细胞荷瘤裸鼠模型的制备 鼻咽癌CNE-2细胞常规传代培养，取对数生长期细胞用胰酶消化，用含50%基质胶的RPMI-1640培养液(不含血清)制成细胞悬液，以1×107个/mL的细胞密度植入裸鼠背部皮下，每只接种0.2 mL。然后每天扪及接种部位观察肿瘤生长情况，以公式V=1/2×a×b2(V表示肿瘤体积，a和b分别表示肿瘤的长和宽)计算肿瘤体积。当肿瘤体积>100 mm3时，将荷瘤裸鼠进行随机分组。

2.3 分组及给药 将32只肿瘤体积>100 mm3的荷瘤裸鼠进行随机分组，分为模型对照组(control)、顺铂组(cisplatin，每周6 mg·kg-1)、顺铂联合玉屏风颗粒组[cisplatin+YPF，6 mg·kg-1+4 g·(kg·d)-1]、玉屏风颗粒组[YPF，4 g·(kg·d)-1]，每组8只动物。分组当天开始给药。模型对照组每天给予蒸馏水灌胃；顺铂组腹腔注射顺铂注射液，剂量为6 mg·kg-1，每周给药1次，共4周；顺铂联合玉屏风颗粒组除每周腹腔注射等剂量顺铂外，每天给予玉屏风颗粒药液灌胃，剂量为4 g·kg-1；玉屏风颗粒组每天给予玉屏风颗粒药液灌胃，剂量为4 g·kg-1，各组连续给药28 d。

2.4 评价指标及检测方法 各组自给药之日起，每间隔一天称量各组裸鼠体重，绘制体重-时间变化曲线；并测量肿瘤体积：以游标卡尺测量肿瘤的大小，以V=1/2×a×b2(V表示肿瘤体积，a和b分别表示肿瘤的长和宽)计算肿瘤体积，绘制肿瘤体积-时间变化曲线；实验结束时计算各组相对肿瘤增殖率T/C(%)，T/C(%)=TRTV/CRTV×100%(TRTV指治疗组RTV，CRTV指阴性对照组RTV)，RTV(relative tumor volume)代表相对肿瘤体积，计算公式为RTV=Vt/V0，其中V0为分笼给药时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。

各组从接种鼻咽癌CNE2细胞之日起算，观察生存周期，共观察51 d。

2.5 统计方法 细胞实验：采用SPSS 18.0统计软件，One-way ANOVA分析各给药组及对照组间细胞存活率的差异，P<0.05为具有显著性差异；采用Regression-probit回归分析药物浓度与细胞存活率间的关系，计算细胞半数存活浓度IC50。

动物实验：采用One-Way ANOVA分析各给药组与对照组间体重及肿瘤体积的差异，P<0.05表示有显著性差异。采用Kaplan-Meier法分析各组生存期。

3 实验结果

3.1 玉屏风颗粒对鼻咽癌CNE-2细胞存活率的影响 鼻咽癌CNE-2细胞加入不同浓度的玉屏风颗粒药液后，部分浓度组出现细胞病变，表现为细胞粘连、壁厚、变圆、破碎、脱落，吸光度值下降。

如图1所示，与对照组相比，玉屏风颗粒组12.5 mg·mL-1(P<0.01)、50.0 mg·mL-1(P<0.01)及200.0 mg·mL-1(P<0.01)对鼻咽癌CNE-2细胞有明显的抑制作用，并随玉屏风浓度的增加，抑制作用增强，其余各组与对照组无显著性差异(P>0.05)；经回归分析，得回归曲线Probit(p)=1.131-0.022X，据此计算得半数细胞存活浓度IC50=28.68 mg·mL-1。

3.2 玉屏风颗粒对鼻咽癌裸鼠体重的影响 根据荷鼻咽癌裸鼠给药后所绘制体重-时间变化曲线，如图2所示。对照组在治疗第一周，体重稍有增加，达到初始体重的102.5%，随后体重开始降低，在治疗第三周时，降到最低，为初始体重的96.3%，随后体重又开始回升，在治疗第四周时，达到初始体重的101.6%。玉屏风颗粒组则一直保持体重的增加状态，整个治疗周期体重保持在初始体重的104.3%，最高达到初始体重的105.8%，与对照组有显著性差异(P<0.05)，说明玉屏风颗粒能促进荷鼻咽癌裸鼠体重的增加。顺铂组在开始治疗后，与对照组相比，裸鼠体重开始显著下降，在治疗第二周末时，体重下降为初始体重的75.2%，与对照组有显著性差异(P<0.01)，并出现裸鼠死亡；顺铂+玉屏风颗粒组体重的变化趋势与顺铂组无显著性差异，但在治疗第二周末时未出现裸鼠死亡情况。结果表明，与对照组相比，玉屏风颗粒组能显著增加荷鼻咽癌裸鼠的体重，顺铂则显著降低裸鼠的体重，表现出一定的毒副作用；顺铂与玉屏风颗粒联合给药与顺铂单独给药相比，对裸鼠体重的影响差异不明显，可能是因为顺铂的毒性较大，使裸鼠的体重严重降低，掩盖了玉屏风颗粒对裸鼠体重的增加作用。

3.3 玉屏风颗粒对荷鼻咽癌裸鼠肿瘤体积的影响 荷鼻咽癌裸鼠开始给药后，根据肿瘤体积大小绘制肿瘤体积-时间变化曲线，如图3所示。

在实验观察期内，根据肿瘤体积-时间曲线，可见随着时间的延长，各组肿瘤体积都呈逐步增大趋势，在观察末期，与对照组相比，玉屏风颗粒组(P<0.05)、顺铂组(P<0.05)及顺铂联合玉屏风颗粒组(P<0.05)肿瘤体积都明显减小，差异具有显著性(P<0.05)。说明给药组均能显著抑制肿瘤的生长。但顺铂组与顺铂联合玉屏风颗粒组间差异不显著(P>0.05)，可能是顺铂对肿瘤体积的抑制作用远大于玉屏风对肿瘤体积的抑制作用，从而掩盖了玉屏风的作用，使两组间肿瘤体积差异不显著。实验期末各组相对肿瘤增殖率见表1。

表1 相对肿瘤增殖率

3.4 玉屏风颗粒对荷鼻咽癌裸鼠生存期的影响 在观察期末，顺铂组裸鼠全部死亡，对照组裸鼠生存率为37.5%，玉屏风颗粒组裸鼠生存率为71.4%，顺铂联合玉屏风颗粒组裸鼠生存率为50%。各组间生存率有显著性差异(P<0.01)，对照组平均生存期为48.2 d，中位生存期为50 d；顺铂组平均生存期为37 d，中位生存期为36 d。玉屏风联合顺铂组平均生存期为46 d，中位生存期为52 d。玉屏风组平均生存期为50.7 d，中位生存期大于52 d，结果见图4。结果表明，与对照组、顺铂组及顺铂联合玉屏风颗粒组相比，玉屏风颗粒组表现最优，对荷鼻咽癌裸鼠的生存期有显著延长作用；玉屏风颗粒与顺铂联用组亦能显著延长裸鼠的生存期，但并未能优于玉屏风颗粒组，说明顺铂的毒副作用较强，需评估给药剂量、抑瘤作用与生存期之间的相关性。顺铂组尽管在短期内肿瘤体积缩小明显，但在观察末期，所有动物均死亡，提示本实验剂量下，顺铂的毒副作用占主导地位。

4 讨论

目前鼻咽癌的临床治疗，以原发灶放疗结合铂类药物化疗为主，但患者治疗生存率一直较低。本实验中，顺铂组给药剂量的大小是依据患者临床给药剂量折算到鼠类给药剂量，实验中观察到顺铂给药组能在短期内显著降低肿瘤体积，表现出较好的肿瘤抑制作用，但同时显著降低荷瘤动物体重，动物消瘦、体态暗沉、萎靡不振、活动率低，表现出明显的毒副作用，长期生存率观察也发现明显低于对照组及其他给药组，说明本实验中，其毒副作用远大于其抑制作用，提示在药效与毒副作用之间，需根据患者状态，严格评估给药剂量。

越来越多的研究表明，综合考虑肿瘤抑制率、生存期、生活质量等指标，延长患者生存率，提高生活质量，带瘤生存，将成为肿瘤治疗的主要方向[10-11]。中医对鼻咽癌的临床治疗，主要通过辨证施治，提高放化疗疗效，减轻放化疗毒副反应，改善生活质量，延长生存期为主，临床用药多为含清热解毒、活血化瘀、补虚、拔毒化腐、消肿敛疮、提高免疫类中药的大验方[12-13]。玉屏风方药作为经典的扶正固本方剂，具有多重药理效应，对肿瘤的作用，主要认为是增强机体的抗肿瘤免疫功能[14-15]。本研究发现玉屏风颗粒对鼻咽癌细胞增殖有一定的抑制作用，但IC50值较高，说明其对肿瘤的直接杀伤作用无明显优势，但动物实验结果却发现玉屏风颗粒组及玉屏风颗粒联合顺铂组的生存期均优于对照组和顺铂组，说明玉屏风颗粒能显著延长荷鼻咽癌裸鼠生存期，这可能与其扶正固本及对顺铂所致小鼠脏器氧化损伤具有保护作用有关[16]。单独使用玉屏风颗粒时，能增加裸鼠体重，但与顺铂联用时，由于化疗药物给药剂量较高，其毒副作用强，掩盖了玉屏风颗粒对裸鼠体重的正向调节作用；玉屏风颗粒与顺铂联用时，尽管相对肿瘤增殖率显著优于玉屏风颗粒组，但生存期指标却显著低于玉屏风颗粒组，也提示了顺铂的毒副作用。本实验所用裸鼠为无胸腺的免疫缺陷鼠，因此玉屏风颗粒对于肿瘤的抑制机制，对机体的保护作用机制都值得进一步深入探讨。

综上所述，本实验表明玉屏风颗粒对鼻咽癌细胞具有一定的抑制作用，并能显著提高荷瘤裸鼠的体重和生存时间，改善生活质量，为玉屏风颗粒在抗肿瘤临床治疗中的科学合理用药提供了实验支持。