超临界流体色谱在药物分析中的研究进展

朱琳

(山西卫生健康职业学院，山西 晋中 030619)

超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography,SFC)是以超临界流体(如二氧化碳)为流动相，以吸附剂(如硅胶)吸附或键合到载体(如毛细管壁)上的高聚物为固定相的一种高效色谱技术[1]。SFC的分离机制与其他吸附、分配色谱相同，即基于化合物在流动相和固定相上的吸附或分配系数不同而使混合物分离[2]。

超临界流体是一类具有液相类似的密度和溶解性能，同时拥有气相类似的低黏度和高扩散等性质的物质。在实际应用中，超临界流体可以避免气相色谱(gas chromatography,GC)的高温，用于分析热不稳定和高沸点化合物，也可像高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)一样分析非挥发性和高分子化合物，且具有比HPLC更快的分析速度和条件，又不需要使用大量的有机溶剂[3-4]。常用做超临界流体的有二氧化碳(CO2)、氨、乙烷、乙烯和氯仿等。CO2的临界温度和压力分别为31 ℃和74 MPa，临界条件容易达到，同时CO2的化学惰性、无毒无害和容易制备，使其成为SFC中最常用的流动相。但是由于CO2极性较小，所以在分析大极性化合物时，需要在流动相添加甲醇等改性剂。此外，从2012年开始，新型的商品化超临界流体色谱系统——超高效合相色谱(ultra performance convergence chromatography，UPC2)在世界范围得到广泛应用与快速发展，UPC2是新一代融合了超高效液相色谱(ultra high performance liquid chromatography,UPLC)技术的超临界流体色谱，在保留SFC技术特点的同时提高了系统的耐压性，促进了样品的高通量分析[5]。同时，UPC2可以直接进样有机提取物[6]，简化了分析时的样品处理过程，UPC2也可以联用多种检测器，实现在线色谱技术[7]。自此，SFC技术在药物分析领域受到了极大的关注和广泛的应用。本研究中，通过查阅大量文献，拟从SFC在手性药物、天然产物、药物代谢和杂质检测等方面的应用进展做简要概述，以期对科研工作者提供帮助。

1 SFC在手性药物分离分析中的应用

手性对映体广泛存在于自然界中，据统计，现有上市药物中，50%都存在手性对映体[8]。同一对手性药物，二者呈现出的药理作用、毒副作用、药动学特征是可能完全不同的。因此进行手性药物的拆分，对药物的质量控制及药效评价具有重要的意义[9]。SFC在分离手性药物方面做出了突出贡献。SFC常用的分离方法有直接分离法和间接分离法。直接分离法又分为手性固定相法和手性流动相添加剂法，前者通过手性固定相营造光学环境、提供手性中心来分离对映体，后者通过固定相吸附手性添加剂从而形成非对映异构体复合物；间接分离法是通过药物外消旋体与手性衍生化试剂反应来引入另一个手性中心，形成非对映异构体复合物。手性固定相分为正相、反相和多模式固定相，常用正相固定相有Pirkle固定相、氨基酸及π-酸、π-碱类，反相固定相有环糊精类、大环抗生素类，多模式固定相有多糖类、螺旋型手性聚合物类[10]。

谢依棋等[11]分别采用超临界流体色谱法和高效液相色谱法分离肾上腺素对映异构体，建立并比较了两种肾上腺素异构体的分离方法，结果显示：两种方法均可应用于肾上腺素对映异构体的拆分及定量，但是在保证最佳分离效果的前提下，两种对映体在SFC法中保留时间明显比HPLC法短，表明SFC法分析效率更高；从定量结果来看，SFC法峰形更好，定量更准确。同时，SFC系统分析方法高效节能，绿色环保。贺建峰等[12]以Enantio Pak AD和Enantio Pak IC多糖手性固定柱为载体，采用超临界流体色谱技术对尼莫地平、氨氯地平、非洛地平和阿折地平等手性药物进行了手性分离。探究了不同的温度和碱性添加剂对手性分离的影响。Miao等[13]考察了6种手性三唑类杀菌药的实现分离分析的色谱条件，利用Thar SD-ASFC-2 色谱系统，探讨不同手性色谱柱、改性剂种类及比例和背压对试验的影响。作者对比了Chiralcel OD-H柱、Sino-Chiral OJ柱和Chiralpak IB柱3种色谱柱，结果表明Chiralcel OD-H柱相比于另外两个柱子有更好的分离效果，主要原因可能是Chiralcel OD-H柱能与杀菌药形成氢键作用力；作者也对比了甲醇、乙醇、异丙醇3种改性剂的优劣，不同药物加入的最佳改性剂以及比例都不同，但相同的是如果不加任何改性剂，3种柱对于所有的杀菌药分离时间都超过了60 min，而加入改性剂可将时间缩短20 min以上，这可能与待测物的极性较大有关。

除了手性化学药以外，越来越多的中药成分也被发现存在手性异构，加上中药本身成分复杂，进一步增加了分离分析的难度。目前主要采用色谱法来进行分离分析。刘佩等[14]建立一种新的丹参素冰片酯和丹参素异丙酯的合成方法并运用SFC技术对其进行手性化合物分离，分离效果好，光学纯度高，促进了手性丹参素酯类衍生物的工业化生产，为手性中药的分离提供了新思路。王波等[15]运用超高效合相色谱探究分离芳樟醇对映体的最佳条件，考察了改性剂、动态背压、温度、进样量的影响，试验显示：乙腈相比于甲醇对芳樟醇分离效果好，峰形尖锐；当背压在1 500～2 000 psi范围变化，1 650 psi时的分离度最高，原因可能是由于压力提高，CO2的密度升高，溶剂化能力变差；当温度在30～50 ℃变化，30 ℃的分离度最高；进样量对超高效合相色谱的分离效果影响较大，当进样量为10 μL时，已经完全无法分离，而进样量为3 μL分离效果较好。最后，作者综合各项影响因素优化形成一个较好的色谱条件，实现了对芳樟醇对映体的有效分离。该法与HPLC、GC相比，具有效率高、重现性好的优点，并且操作简单。

2 SFC在天然产物分离分析中的应用

天然产物中的脂肪酸甘油酯、黄酮类、生物碱类等活性成分是药物与先导化合物的重要来源，这类成分在生物体内含量差异大，且分离过程中受诸多因素的限制，如：耗时长，效率低，费溶剂等，因此周期短、效率高、绿色环保的分离技术引起越来越多的人的关注[16-17]。

2.1 脂肪酸和甘油酯 动植物油酯具有较高的营养价值、抗氧化能力及生物活性。由于其极性较小、组成复杂，目前常用的分析方法为先衍生化处理使转化为脂肪酸甲酯，再采用GC/GC-MS进行分析。但这会给分析工作带来两个方面的问题，其一是衍生化前处理程序烦琐，增加了工作量；其二是衍生化处理破坏了甘油酯的初始组成，使分析的结果只能反映脂肪酸的种类，不能真实反映脂肪酸甘油酯的具体成键位置。超高效合相色谱技术的应用可以很好地解决这一问题。林春华等[18]使用超高效合相色谱实现了快速分离分析食用植物油中的棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等5种常见的脂肪酸，并对其进行含量测定，此法不需要衍生化，更加方便快捷，为食品营养质量鉴定和安全提供方法。Tu等[19]运用超临界流体色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术，实现了对牛奶和羊奶中复杂的甘油酯成分的分离分析。作者采用Acquity UPC2BEG2-EP色谱柱，甲醇∶乙腈∶甲酸=50∶50∶0.1作为改性剂进行梯度洗脱，柱温50 ℃，背压11 MPa，流速1.0 mL·min-1，进样量1 μL，该方法能在25 min内分离出16种甘油二酯以及55种甘油三酯，并且找出了羊奶与牛奶成分之间的主要差异，发现了不同脂肪酸在甘油上的占据位置的规律。朱文星等[20]建立了超高效合相色谱串联四级杆飞行时间质谱快速测定中/长链结构甘油三酯中甘油三酯组成的分析方法，并对其成分进行了结构确认。

2.2 生物碱 对于生物碱的色谱分析，目前以薄层色谱法(TLC)，HPLC法和高速逆流色谱(HSCCC)法为主。TCL法分离效率不高，多用于该类化合物的鉴别实验上。HPLC是该类化合物最常用的色谱分析方法，除此以外，高速逆流色谱也可用于分析和制备复杂体系中的生物碱[21]。但是这些方法均存在分离效率不高和分析时间过长等问题，因此需要发展一种新的快速高效分析生物碱的方法。李振宇等[22]建立了采用SFC快速分离分析吴茱萸中吲哚类生物碱和雷公藤中倍半萜类生物碱的方法。通过考察不同色谱柱、进样量、柱温、背压、改性剂对峰形和出峰时间的影响，最终实现在15 min对吴茱萸中吲哚类生物碱的分离分析，通过与UHPLC的分析结果比较，证明两者有很好的正交性，表明SFC串联LC二维方法具有一定的应用前景，可用于天然产物的分离分析。除此之外，作者还成功分离了雷公藤中倍半萜类生物碱复杂样品，最佳色谱条件为Waters Acquity UPC2BEH 2-EP色谱柱、2%甲醇改性剂、柱温45 ℃、背压2 000 psi、进样量1 μL、流速1.0 mL·min-1，在10 min完成了复杂样品的分离。

2.3 黄酮类 研究表明，约有20%的中草药中含有黄酮类化合物，大多数黄酮类化合物具有多种生理功能和药用价值，对疾病防治以及人体健康维护都有积极意义。黄酮类化合物主要的分离方法有柱层析法、离心薄层层析法、纸层析法[23]等。而这些方法存在提取效率低、分离过程麻烦、提取剂毒性大等缺点。而超临界流体色谱对于黄酮类化合物是一种非常有效的提取方法。吕惠生等[24]应用SFC技术从赤芍粗提物中同时分离并制备芍药苷与芍药内酯苷活性组分。其采用半制备的CN色谱柱，考察了夹带剂、CO2流量、柱压、柱温对分离效果的影响。为模拟制备型超临界色谱大规模分离和制备芍药苷和芍药内酯苷产品提供基础数据和技术支持。王波等[25]使用超高效合相色谱法快速分离了黄芪中5种黄酮类化合物，分别考察了不同色谱柱、色谱条件对5种黄酮类化合物分离能力的影响，最终确定流速0.4 mL·min-1、甲醇为改性剂进行梯度洗脱、背压11.72 MPa、柱温40 ℃为最佳条件，能够在15 min实现对复杂黄酮类化合物的有效分离。王学军等[26]将超临界流体色谱技术应用于银杏叶提取物中黄酮类化合物槲皮素和芦丁的含量测定。方法高效快速，条件温和、定量准确。相对于其他黄酮类化合物的分离方法，如液相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱法，超临界流体色谱具有仪器便宜、特异性强、精确度高、分离时间短的优势。

2.4 内酯类 内酯类成分的传统分离纯化方法，多采用有机溶剂提取-硅胶柱色谱、高速逆流色谱等。这些方法均需消耗大量的有机溶剂，不仅浪费资源、污染环境，还难以保证产品的质量。莫绪飞等[27]采用SFC技术提纯当归挥发油中Z-藁本内酯。通过考察流速、改性剂、温度、压力对色谱分离过程的影响，确定了较合适的色谱条件：CO2流速10 g·min-1，柱温313.15 K，柱压14 MPa；在此条件下得到了纯度为98.5%的Z-藁本内酯单体。于琳琳[28]建立了SFC分离纯化木香中木香烃内酯和去氢木香烃内酯的方法，并对色谱分离过程的热力学规律进行了研究，指出该条件下的SFC分离过程为晗控过程。秦秀秀[29]以使用SC-CO2作为SFC流动相的主体，添加体积分数为5%的乙醇，建立了从穿心莲中分离测定穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯的SFC方法。

2.5 糖类 糖类是人体的最主要能源物质，其分离分析方法备受关注。常用的分离方法是GC法和HPLC法。但由于糖类的挥发性小，采用GC法常需要衍生。HPLC法虽不需要衍生化，但需使用糖分析柱(氨基柱)成本高，不适于扩大生产。齐建平等[30]采用自行研发的超临界流体色谱仪成功分离了木糖、葡萄糖和蔗糖。通过优化有机改性剂种类、浓度、系统背压、流速和温度实现了在10 min内对三种糖类的有效分离。扩展了新型超临界流体色谱仪的应用范围。

3 SFC在药物代谢中的应用

药物进入机体经过吸收、分布后，在体内多种药物代谢酶(尤其肝药酶)的作用下，化学结构发生改变，完成生物转化，称为药物代谢。由于机体内血浆蛋白、内源性物质等成分的干扰，使体内药物的分离分析工作更加困难，药物代谢检测技术的要求也随之提高。张淑丽等[31]建立了运用超高效合相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术研究果糖诱导的高尿酸血症血清中脂质代谢组学的方法，对比模型组和对照组的代谢图谱，筛选出11个不同代谢物，为高尿酸血症的早期诊断和预防提供了依据。刘蕊[32]研究并建立了UPC2-MS/MS系统测定人体血浆中双环醇含量分析方法。与HPLC系统相比分析时间更短(4 min)，灵敏度更高，更加环保。该方法能够满足双环醇临床药物代谢动力学研究的要求，可用于双环醇药物代谢动力学相关研究。孟祥骏[33]创新性地建立了一种快速简单且灵敏度高的用于同时测定大鼠血浆中洛铂两个非对映异构体的SFC-MS/MS分析方法，可用于研究洛铂两个非对映异构体在药代动力学上的立体选择性，为体内药物分析提供了新思路。Hsieh等[34]通过填充柱超临界流体色谱-大气压化学离子-串联质谱(pSFC-APCI/MS/MS)法进行了氯氮平、昂丹司琼、甲苯磺丁脲和扑利酮的代谢稳定性实验。

4 SFC在杂质检测中的应用

使用超临界流体色谱还可以对药物中杂质进行分离分析。王勇越[35]首次利用UPC2-Q-TOF对阿洛西林钠中的聚合物进行了分析鉴定，从质谱图的信息中推测从UPC2分离出的峰为杂质聚合物峰。该法分离度良好，实现了采用超临界流体色谱分离杂质。赵红海[36]使用反相HPLC和超临界流体色谱(SFC)及手性制备色谱技术对庚酸炔诺酮中的两个痕量杂质进行分离纯化，并对这两个杂质进行了结构确认。

5 结语

通过归纳超临界流体色谱在分析化学中的应用进展，能认识到以下几个问题：首先，SFC对比HPLC、GC这些广泛使用的色谱技术，存在明显优势，尤其是在手性化合物的分离分析方面，所以研究人员在有分离手性化合物的需求时，可以优先考虑SFC或者UPC2，除此之外，SFC还普遍具有分离时间短的特点，此特点可以用于大量样品的分离分析以节省时间、提高效率，且SFC的常用流动相CO2无毒、绿色，这一点在当今全球污染趋势严峻的现状下难能可贵； 其次，不论SFC还是UPC2仍然具有它们不可忽视的缺点，那就是可用的流动相种类非常有限，超临界CO2作为最常用的流动相，不能洗脱极性化合物，同时对结构或分子量相似的物质的分离能力不足，虽然添加改良剂或添加剂能够改善上述情况，但流动相中加入有机溶剂后不能采用氢焰离子化检测器，限制了其使用，因此需要积极开发新的更加全面的流动相。