巨噬细胞在肠稳态及肠炎症中的募集和分化

林燕婷，杨勇

(中国药科大学药物科学研究院，江苏 南京 211198)

肠道作为机体最大的免疫系统，长期暴露在微生物和食物蛋白等外来抗原中，因此，机体需要将有害和无害的抗原加以区分，确保机体产生适当的免疫反应。在肠道免疫中，单核细胞(monocytes)、巨噬细胞(macrophages)和树突状细胞(dendritic cells)三者组成的单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system，MPS)[1]在区分共生的抗原、潜在病原体及解决炎症反应等方面发挥着不可或缺的作用。如果这一过程被破坏，将产生过度的免疫反应，促进慢性炎症的发生、发展，如炎症性肠病(IBD)、类风湿性关节炎等。而巨噬细胞是确保机体产生适当免疫，维持免疫平衡的关键组成部分。组织中的巨噬细胞是高度分化的特异性的吞噬细胞，它们不仅能够对代谢变化、组织损伤和微生物入侵等做出反应，它们还能够执行组织特异性功能来支持周围细胞和结构[2]，从而维持组织稳态。位于不同组织的巨噬细胞具有不同的功能，例如，肺泡巨噬细胞能够特异性地去除和回收肺泡上皮细胞产生的表面活性剂分子[3]；在大脑中，驻留的巨噬细胞称为小胶质细胞，它们能够协助突触修剪和提供神经营养因子[4]；而在肠道固有层中，驻留的巨噬细胞促进肠道局部的免疫耐受，维持肠稳态[5]。因此，了解巨噬细胞在肠稳态及肠炎症情况下的募集和分化过程，对于优化旨在解决炎症的治疗具有重要的意义。在本篇文章中，首先我们将简要介绍目前对肠组织巨噬细胞异质性的认识，接着阐述巨噬细胞在肠稳态及肠炎症情况下的募集和分化过程，最后回顾靶向巨噬细胞治疗IBD药物的研究进展。

1 肠巨噬细胞的起源

随着谱系追踪(fate mapping)、异种共生(parabiosis)等新技术的出现，有越来越多的文献表明，组织器官中的巨噬细胞来源于造血和胚胎衍生的前体细胞。包括大脑、肝脏和腹膜在内的大多数组织，如大脑中的小胶质细胞，表皮的朗格汉斯细胞，肝脏中的枯否细胞，肺泡巨噬细胞以及腹膜中的巨噬细胞均来源于胚胎前体细胞，这些细胞在胚胎发育早期就已经存在组织中，并且它们可以通过原位自我更新维持自身稳态，而血液来源的单核细胞对于组织中巨噬细胞的补充几乎没有贡献[6]。然而，肠道组织是一个例外，在肠稳态及肠炎症情况下，成体肠道组织中的巨噬细胞都需要血液中单核细胞的不断补充[7]，而单核细胞是由骨髓中的祖细胞分化而来[8]。单核细胞在骨髓中分化过程是受到细胞因子调控的。骨髓中的多能造血干细胞在白介素(interleukin，IL)-1、IL-6和IL-3的刺激下持续分裂，形成髓系祖细胞。髓系祖细胞在IL-3和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)刺激下，发育为粒细胞-单核细胞祖细胞。而粒细胞-单核细胞祖细胞又能在IL-3、IL-1和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，G-CSF)的持续刺激下，首先分化为成单核细胞，进而分化为幼单核细胞，最终分化为单核细胞[9]。转录因子也参与了单核细胞在骨髓中的分化过程。急性髓细胞白血病基因AML1可通过两种不同的剪接形式来调节造血髓细胞的分化和转录活化[10]。PU.1作为ETS家族的转录因子，在髓细胞的存活、增殖和分化中扮演着重要角色，且在B淋巴细胞、粒细胞和单核细胞中高表达[10]。PU.1通过调节M-CSF受体(M-CSFR)、粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)、GM-CSF受体(GM-CSFR)和清道夫受体等的表达，进而调节髓细胞分化过程[11]。低浓度的PU.1诱导B细胞的死亡，而高浓度的PU.1则会促进巨噬细胞的分化，因此也可通过调节PU.1浓度来调节髓细胞的分化[12]。C/EBPα、C/EBPβ、HOXB7、c-Myc、EBR-1、IRF-1、NF-Y、c-Jun、c-Fos和某些信号转导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)等转录因子能够调节单核细胞的成熟，而GATA-2、SCL和c-Myb等转录因子则能够调节髓细胞的存活[13]。分化成熟的单核细胞离开骨髓后，进入血液循环系统中待命。

肠组织中的巨噬细胞是否都来源血液中的单核细胞呢？Shaw等[14]在2018年的时候，发现小鼠肠道巨噬细胞由两种亚群组成，一种是单核细胞来源的短寿命TIM4-CD4-巨噬细胞亚群，另外一种是非单核细胞来源的长寿命的TIM4+CD4+巨噬细胞亚群。同年，De Schepper等[15]在小鼠上的研究进一步证实了巨噬细胞在肠道中具有异质性，其中一种巨噬细胞亚群来源于胚胎前体细胞，它们在整个成年期都能维持自我更新。此外，在一项人十二指肠移植实验中，研究人员也发现在肠固有层和黏膜下层中存在一种寿命较长、能够自我更新、非单核细胞来源的巨噬细胞[16]。综上所述，在肠道中既存在非单核细胞来源的巨噬细胞，同时也有从单核细胞分化而来的巨噬细胞，两者共同维持肠稳态。

2 单核细胞的分类

根据趋化因子受体和特异性表面分子的表达情况，可将单核细胞分为不同的亚群。小鼠的单核细胞根据淋巴细胞抗原C(lymphocyte antigen 6C，Ly6C)和CD11b表达的不同，分为Ly6Chi和Ly6Clow单核细胞。Ly6Chi单核细胞为炎性单核细胞，高表达CC-趋化因子受体(CC-chemokine receptor，CCR)-2，低表达CX3C-趋化因子受体1(CX3C-chemokine receptor，CX3CR1)。当小鼠肠道处于感染或炎症环境下，Ly6Chi单核细胞能够在趋化因子的作用下，迁移到炎症部位，参与反应[17]。另外一种循环单核细胞为Ly6Clow单核细胞，它们高表达CX3CR1，低表达CCR2和Ly6C，负责在血管腔中巡逻，清除坏死的内皮细胞[18]。因此，在某种程度上而言，Ly6Clow单核细胞是血液循环系统中的巨噬细胞。

人单核细胞根据表面CD14和CD16的表达分为不同的亚群，分别为CD14hiCD16-、CD14lowCD16hi和CD14hiCD16low单核细胞[19]。CD14hiCD16-单核细胞相当于小鼠的Ly6Chi单核细胞，为经典的单核细胞，是人血液中最常见的单核细胞亚群。CD14hiCD16low单核细胞亚群为中间体，具有促炎作用。而CD14lowCD16hi单核细胞亚群相当于小鼠的Ly6Clow单核细胞，为非经典的单核细胞，负责在血管腔中巡逻[20]。

3 肠巨噬细胞的募集

细胞因子、趋化因子和整合素等参与了单核细胞向结肠黏膜的募集过程。在肠稳态下，肠黏膜上皮细胞和肥大细胞持续产生的转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-8结合到固有层细胞外基质中并释放。由肠道固有层细胞外基质释放的TGF-β和IL-8能够招募血液中的单核细胞，而它们却不能趋化分离的肠道巨噬细胞[21]，说明TGF-β和IL-8为特异性招募单核细胞至结肠固有层的细胞因子。此外，成熟的巨噬细胞可通过分泌单核细胞趋化因子如CC-趋化因子配体(CC-chemokine ligand，CCL)-2、CCL7、CCL8和CCL12等来调节单核细胞向结肠黏膜募集，促进成熟巨噬细胞的自我更替[22]。

在肠稳态及肠炎症情况下，CCL2-CCR2轴在招募单核细胞至结肠黏膜中起重要作用。研究证明Ly6Chi单核细胞能够分化为肠道巨噬细胞，而且将小鼠的CCR2基因敲除以后，结肠组织中的巨噬细胞也随之减少[7]。此外，用白喉毒素处理CCR2-白喉毒素受体(diphtheria toxin receptor，DTR)转基因小鼠以后，可消除其肠道中的巨噬细胞[23]，进一步说明了肠组织中巨噬细胞的补充依赖于CCR2。近年来，越来越多的文献报道，在某些炎症反应中，Ly6Chi或CD14hi单核细胞的募集并不是都依赖于CCR2。例如，在H.hepaticus诱导的结肠炎中，CCR2缺失并不影响单核细胞的募集[24]。小鼠和人的单核细胞均能够表达趋化因子受体CCR5，而CCR5已被证明在某些炎症情况下能诱导单核细胞趋化[25]。而且，CCR5缺失小鼠能够减轻DSS诱导的结肠炎[26]。此外，有研究报道在DSS诱导的结肠炎中，肠组织中的CD169+巨噬细胞亚群通过分泌CCR2/CCR3/CCR5配体CCL8招募单核细胞至固有层中[27]。整合素αLβ2、αMβ2和α4β7等也参与了单核细胞向结肠黏膜募集过程。近年来的一项研究表明，抗α4β7抗体影响了结肠炎患者和小鼠结肠中非经典单核细胞向结肠黏膜迁移，导致促进伤口愈合的巨噬细胞数量减少[28]。

4 巨噬细胞在肠稳态及肠炎症反应中的分化过程

4.1 巨噬细胞在肠稳态下的分化过程 Ly6Chi单核细胞从血液循环中进入肠道固有层后，逐渐分化，首先获得主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ)表达，紧接着上调CX3CR1、CD64和F4/80的表达。MHC Ⅱ表达的上调是小鼠和人肠道黏膜单核细胞分化的首要特征，但确切的上调机制目前尚不清楚。虽然血液单核细胞和结肠单核细胞在表型上相似，但是它们之间存在转录差异。而且这种转录差异是具有组织特异性的，如结肠单核细胞与真皮单核细胞之间也存在转录差异[29]。

由单核细胞分化而来的肠驻留型巨噬细胞能够分泌多种抑炎因子、趋化因子和其他促进肠道修复的可溶性因子。其中，肠驻留的巨噬细胞分泌的前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和WNTs能够刺激肠上皮干细胞的自我更新，从而维持肠上皮屏障的完整性[30]。肠驻留型巨噬细胞也能够增加IL-10等抑炎因子的分泌。IL-10不仅能够直接调节新募集的单核细胞，还能够促进肠黏膜内的调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的二次扩增，通过Treg产生TGF-β来间接调节新募集的单核细胞[6]。此外，肠驻留的巨噬细胞还能减少诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、IL-6等促炎因子的分泌[7]。虽然人和小鼠的单核细胞亚群并不完全重叠，但是它们的募集和分化过程类似。在肠稳态情况下，人CD14hi单核细胞也能够像小鼠Ly6Chi单核细胞不断进入肠黏膜组织中，通过一系列中间体向驻留型巨噬细胞分化，整个分化过程涉及CD14和CD11c表达的下调，CD209、CD163和MHC Ⅱ的上调[7]。

结肠黏膜单核细胞向组织驻留型巨噬细胞分化过程受到微环境中细胞因子、趋化因子、肠道微生物及其代谢产物等的影响[31]。如巨噬细胞刺激因子1(colony-stimulating factor 1，CSF1)参与了肠巨噬细胞的增殖、分化和生存过程。研究发现，Csf1op/op小鼠的肠巨噬细胞数量明显减少[32]，此外，当用抗CSF1受体抗体处理小鼠时，也能使肠驻留型巨噬细胞显著减少[33]。TGF-β-TGF-β受体(TGF-βR)信号轴在驻留型巨噬细胞的终末分化过程中扮演着重要角色。肠驻留型巨噬细胞中的稳态相关基因的上调依赖TGF-β-TGF-βR信号轴，如CX3CR1、IL-10、αvβ5整合素等[29]。TGF-β来源于结肠黏膜中的多种细胞，其中巨噬细胞是重要的来源之一。巨噬细胞可通过胞葬作用上调TGF-β的表达[34]，而在人体中，巨噬细胞也可通过整合素β8的表达活化TGF-β[35]。巨噬细胞在摄取凋亡的上皮细胞之后，启动了肠巨噬细胞本身的抗炎程序[36]。除了TGF-β-TGF-βR信号，上皮细胞表达的Notch配体也能调节巨噬细胞的分化。Ishifune等[37]研究表明，当Notch信号缺失时，巨噬细胞的分化过程将被破坏。

越来越多的研究表明，CX3CL1-CX3CR1轴能够调节巨噬细胞的分化过程。肠固有层巨噬细胞通过CX3CL1-CX3CR1轴形成的跨上皮突触(transepithelial dendrites，TEDs)进入肠腔进行采样[38]。而且研究表明缺乏CX3CR1的巨噬细胞将产生更少的IL-10，这提示我们CX3CL1-CX3CR1轴能够促进肠巨噬细胞向调节型巨噬细胞分化[39]。此外，还有研究报道CX3CR1缺失小鼠更容易受到化学试剂诱导的结肠炎的影响[40]。αvβ5整合素也能调控肠巨噬细胞的分化过程，研究发现，αvβ5整合素缺失的小鼠肠道中成熟的巨噬细胞明显减少，且IL-10的表达下调[41]。

IL-10-IL-10受体(IL-10R)轴在调节巨噬细胞分化过程中起基础作用。尽管在小鼠髓细胞中特异性敲除IL-10不会自发结肠炎[42]，但在巨噬细胞上特异性敲除IL-10R时，小鼠却能够自发结肠炎[43]。此外，当IL-10-IL-10R信号阻断时，巨噬细胞对Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)的刺激产生高反应性，从而使小鼠和人自发肠道炎症。与上述研究结论一致，研究人员在早发型IBD患者中发现Il10RA和Il10RB基因存在多态性[44]，将患者的单核细胞分离出来，体外诱导成巨噬细胞，发现这种巨噬细胞对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的刺激反应更加强烈[45]。以上研究表明IL-10-IL-10R信号能够促进巨噬细胞向抑炎巨噬细胞分化。IL-10-IL-10R信号缺失引起的过度炎症反应可能是由于调节巨噬细胞活化的相关分子发生改变或可能依赖IL-10R信号进行染色质重构受到限制，改变了促炎基因的可及性[46]。如在IL-10R信号缺失的情况下，机体不能下调TREM-1和STAT1等炎症增强分子，或STAT3的激活不足[43]等都能引起过度的促炎反应。此外，IL-10R还可以通过诱导NF-κB的负向调节因子的表达来限制炎症反应[47]。

肠道微生物及其代谢产物也会影响巨噬细胞的分化过程。研究表明，从无菌小鼠中分离出巨噬细胞对TLR刺激产生高反应性，说明肠道微生物的定殖有助于结肠巨噬细胞向抑炎表型分化。肠道微生物也可通过代谢产物影响巨噬细胞的分化，如短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)家族中的丁酸盐可通过抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，从而抑制结肠巨噬细胞中Il6、Il12b和Nos2的表达[48]。

4.2 巨噬细胞在肠炎症反应中的分化过程 在肠炎症情况下，先天免疫系统检测到损伤相关的分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPS)和病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPS)，活化TLR或NOD样受体(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR)，从而激活炎症相关信号通路，促进血液循环中的中性粒细胞募集至肠道炎症部位。浸润的中性粒细胞分泌一些趋化因子招募炎症单核细胞至炎症部位，对炎症产生反应[49]。对于小鼠而言，Ly6Chi单核细胞进入肠道黏膜组织后，不能分化为成熟的肠驻留巨噬细胞。Ly6Chi单核细胞进入肠道固有层后，首先分化为效应单核细胞，进而分化为促炎的巨噬细胞，它们能够分泌IL-12、IL-6、IL-1β等促炎因子，促进效应T细胞的维持，如大量产生的Th1和Th17细胞会分泌IFN-γ，损伤肠上皮[7]。此外，促炎巨噬细胞还高表达TREM1，而TREM1已被证明能够放大促炎反应[50]。与此同时，这些未分化成熟的促炎巨噬细胞还能够分泌CCL2，CCL11等趋化因子，招募先天免疫效应细胞至炎症部位，进一步促进炎症的发生发展。如，Waddell等[51]研究发现，Ly6Chi单核细胞通过分泌趋化因子CCL11招募嗜酸性粒细胞。除了促炎的巨噬细胞外，肠道中还存在CX3CR1hi驻留型巨噬细胞，它们保留着抗炎的功能，因此在肠道发生炎症的情况下，仍然可以发挥免疫调节作用[52]。

当人发生肠道炎症时，CD14hi单核细胞进入肠黏膜固有层中，分化为未成熟的巨噬细胞，分泌促炎因子和趋化因子[7]。Grimm等[53]将IBD患者血液中的CD14hi单核细胞分离出来，利用放射性元素99m锝进行标记，然后再接种回患者体内，发现炎症部位中的CD14hi巨噬细胞来源于血液中的单核细胞。另外，研究还发现，在IBD患者肠黏膜中积累了大量CD14hi巨噬细胞，这些巨噬细胞能够产生大量的促炎因子，如IL-6、iNOS和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α等[54]。它们也高表达TREM1，放大肠道的促炎反应[50]，与小鼠促炎巨噬细胞相似。此外，这些促炎巨噬细胞也能够分泌一些趋化因子，趋化其他先天免疫细胞至炎性部位参与反应。如CD14hi巨噬细胞分泌的CCL11，能够趋化嗜酸性粒细胞至炎症部位，加重结肠炎的发展[54]。

在肠炎症反应中，募集至肠黏膜中单核细胞不能分化为成熟的抗炎巨噬细胞，可能是由于巨噬细胞的分化过程受到干扰，但具体的作用机制尚不清楚。如诱导巨噬细胞正常分化的分子被抑制(如TGFβ、IL-10和CX3CL1等)或促炎因子分泌增加(如IFN-γ)都可能影响巨噬细胞的正常分化。研究表明，IBD患者的结肠黏膜中高表达IFN-γ，而IFN-γ能够促进CD14+单核细胞的促炎特性[55]。此外，研究发现IFN-γ受体1(IFN-γR1)或其下游信号分子STAT1缺失小鼠均能够限制Ly6C+促炎单核细胞在结肠黏膜中分化，从而保护DSS诱导的结肠炎[56]。IFN-γ还能通过上调TGF-β-TGF-βR信号的负调控因子(如Smad7)，从而干扰单核细胞分化为成熟巨噬细胞[57]。此外，当发炎的肠黏膜组织缺氧时，也可促进单核细胞向促炎巨噬细胞分化，如在髓系细胞上特异性敲除缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的小鼠能够减轻DSS诱导的结肠炎[58]。

5 靶向巨噬细胞治疗IBD的药物研究进展

随着经济的发展和生活水平的提高，导致IBD发病率和患病率逐年升高。虽然IBD的死亡率低，但患者需要终生用药或进行手术治疗，严重影响了患者的生活质量。根据我国IBD的临床治疗指南，可将治疗IBD的药物分为以下4大类：①氨基水杨酸类：如5-氨基水杨酸、美沙拉嗪等；②糖皮质激素类：如强的松、泼尼松龙等；③免疫调节剂类：如环孢素、他克莫司呤等；④生物制剂类：如英夫利昔单抗、利妥昔单抗等。可是仍然有很大比例的IBD患者对当前的治疗药物没有反应，因此，研发在临床上安全、有效和副作用小的治疗IBD的药物是刻不容缓的。越来越多的证据表明，促进巨噬细胞向抑炎表型分化是治疗IBD的一种新的治疗策略。接下来，我们将简单总结目前已知的、能对巨噬细胞募集和分化产生影响的药物研究进展。

5.1 已上市药物 在美国FDA批准抗TNF抗体药物英夫利昔单抗治疗IBD后，生物制剂得到了进一步发展，成为治疗IBD的重要药物。之后也相继有一些新的生物制剂上市，包括阿达木单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗等抗TNF抗体；首个以IL-12/IL-23 p40亚基为靶点的优特克单抗；以整合素为靶点维多珠单抗、那他珠单抗等。那他珠单抗是一种非肠道特异性的α4整合素抗体，同时阻断α4β7和α4β1，几乎影响到了所有组织和器官中淋巴细胞的募集，副作用较大。而维多珠单抗是一种肠道特异性的α4整合素抗体，只阻断α4β7整合素，能够在不影响其他组织和器官的情况下，特异性地抑制肠道炎症。但是在2019年Gut期刊上发表的一项研究表明，在接受维多珠单抗治疗的IBD患者中的非经典单核细胞的归巢受到了影响，导致患者的肠道愈伤能力减弱[28]。有研究报道使用抗TNF抗体后，能够诱导巨噬细胞向CD206+调节性巨噬细胞极化而发挥治疗作用[59]。在另外一项研究中进一步证实了这一点，抗TNF抗体能通过依赖FcγR方式促进巨噬细胞分泌IL-10，并诱导巨噬细胞向CD206+调节性巨噬细胞极化[60]。

一些免疫抑制剂也可通过诱导巨噬细胞的分化而发挥抗炎作用。如糖皮质激素作为应用比较广泛的免疫抑制药物，能促进单核细胞向抗炎巨噬细胞分化[61]。

5.2 在研药物 免疫抑制剂可导致脱靶的副作用和并发症。因此，科学家这几年也在研发一些疗效好和副作用小的靶向给药系统。如透明质酸-胆红素纳米药物(hyaluronic acid - bilirubin nanomedicine，HABN)能够在肠上皮细胞中积累，与促炎巨噬细胞结合，降低促炎细胞因子的分泌，有较强的治疗IBD的效果[62]。国内团队在2019年发表的一项研究表明，口服nCUR(通过将壳聚糖骨架与丙烯酸反应生成羧乙基团，再与姜黄素酯化获得)后，可将药物聚集于结肠炎小鼠的结肠组织中，抑制巨噬细胞炎性细胞因子的表达，并减轻小鼠的结肠炎症状[63]。当然，还存在其他的靶向巨噬细胞的给药系统，但目前还没有进行临床试验的药物。

6 总结与展望

综上所述，在IBD患者肠道微环境中，单核细胞向成熟的巨噬细胞分化过程受到干扰，促炎因子分泌增加，加重IBD的发展。基于这一理论，提示我们靶向巨噬细胞募集和分化将成为有效的治疗策略，不仅可以重建肠道免疫微环境，还可以恢复炎症后的结肠组织稳态来达到治疗IBD的目的。传统的免疫抑制剂可导致脱靶的副作用和并发症，此外还有一些单抗药物通过注射给药，患者的依从性差，治疗成本高，长期使用容易产生耐药性和不良反应。了解巨噬细胞在肠稳态及肠炎症情况下的募集和分化过程，有助于我们开发一些疗效好、安全性高和副作用小的药物用于IBD的治疗。