UPLC同时测定大血藤中6种成分含量

陈兆榕，叶丽宏，华怡静，金钦，张淑清，许文*，徐伟*

(1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122)

中药大血藤[Sargentodoxacuneate(Oliv.) Rehd.et Wils.]别名为红藤、千年健、血木通等，具有清热解毒，活血，祛风止痛，主治肠痈腹痛，痢疾，闭经，痛经，乳痛，风湿痹痛等疾病[1]。现代化学研究表明，大血藤的化学成分分为有机酸类、黄酮类、苯乙醇苷类等[1-3]。《中国药典》2015年版大血藤尚未收载其含量测定项，鉴别采用对照药材薄层色谱鉴别法，尚没有具体检测的指标性成分[4]。

到目前为止，对大血藤质量控制已有文献报道：韦汉燕等[5]采用高效液相色谱(HPLC)法测定大血藤三氯甲烷部位的指纹图谱；葛明菊等[6]采用HPLC法对大血藤叶片的黄酮类进行分析；荆彦民等[7]采用HPLC同时测定大血藤中绿原酸、咖啡酸和香草酸的含量，丁越等[8]采用HPLC对大血藤药材中绿原酸成分进行含量测定；刘晓涵等[9]采用超高效液相色谱(UPLC)法同时测定大血藤4种化学成分(没食子酸、原儿茶酸、红景天苷、绿原酸)的含量；Li等[10]采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法同时测定3，4-二羟基苯乙醇苷、红景天苷、绿原酸和鹅掌楸碱成分含量，李宛蓉等[11]建立不同产地大血藤药材指纹图谱研究，并对红景天苷和绿原酸的含量进行测定，李浩等[12]对大血藤药材和饮片中绿原酸、3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷和红景天苷及总皂苷进行含量测定。这些文献研究为大血藤质量标准提升提供重要依据，但是目前方法仅测定有机酸类或者苯乙醇苷类的1种或几种，未见同时测定有机酸、黄酮、苯乙醇苷类6种成分的定量分析方法，因此，课题组根据前期课研究，选择大血藤中主要成分包括有机酸类：原儿茶酸和绿原酸，苯乙醇糖苷和苷类：红景天苷、丁香酸葡萄糖苷，黄酮类：原花青素B2、表儿茶素共计6种成分进行UPLC的定量分析评价研究，为其多组分质量控制奠定基础。

1 仪器与试药

1290型超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；CPA225D 型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；KQ-500E 台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。红景天苷(批号：MUST-20121227)和原花青素B2(批号：MUST-17042920)购自成都曼思特生物科技有限公司；丁香酸葡萄糖苷(批号：BPB33228-65-8)购自云南西力生物科技有限公司；原儿茶酸(批号：110809-200604)、表儿茶素(批号：110878-200102)和绿原酸(批号：110753-201716)购自中国食品药品检定研究院。22批次市售大血藤样品(见表1)经过福建中医药大学药学院范世明高级实验师鉴定为木通科植物大血藤[Sargentodoxacuneata(Oliv.) Rehd.et Wils.]的干燥藤茎，样本保存于药用植物学标本室。甲醇、乙腈、水均为色谱纯(上海安谱实验科技股份有限公司)；甲酸为色谱纯(上海阿拉丁试剂有限公司)。

表1 22批大血藤样品

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×100 mm，1.8 μm)，流动相选用乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱，流动相比例：0～2 min，2%A→2%A，2～12 min，2%A→5%A，12～20 min，5%A→6%A，20～30 min，6%A→10%A，30～35 min，10%A→12%A，流速:0.2 mL·min-1，柱温：40 ℃，检测波长为260、275和330 nm，进样量：5 μL。在此色谱条件下6个对照品与其他色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数均大于5 000，色谱峰对称性良好，UPLC色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取各个对照品：原儿茶酸、丁香酸葡萄糖苷、红景天苷、绿原酸、原花青素B2、表儿茶素适量，用色谱甲醇超声溶解，制成质量浓度分别为0.53、0.83、1.02、2.50、1.14、0.66 g·L-1的单一对照品储备液，备用。分别精密量取上述对照品溶液适量，置同一容量瓶中，加入15%甲醇至刻度，即得原儿茶酸26.50 mg·L-1、丁香酸葡萄糖苷83.00 mg·L-1、红景天苷102.0 mg·L-1、绿原酸500.0 mg·L-1、原花青素B2114.0 mg·L-1、表儿茶素66.0 mg·L-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 把大血藤粉碎，过40目筛，精密称取粉末约0.5 g，置于25 mL具塞锥形瓶中，精密加入15%甲醇25 mL，密塞，超声(功率250 W，频率50 kHz)处理30 min，放冷，摇匀，再次称重，15%甲醇补足减失重，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.3 线性范围考察 取原儿茶酸、丁香酸葡萄糖苷、红景天苷、绿原酸、原花青素B2和表儿茶素的混合对照品溶液，用15%甲醇稀释配制为不同梯度浓度的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。以原儿茶酸、丁香酸葡萄糖苷、红景天苷、绿原酸、原花青素B2和表儿茶素质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，得回归方程和线性相关系数r，结果见表2。

表2 大血藤中6个分析物的线性范围考察

2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液5 μL，1 d内连续进样6次，计算原儿茶酸、丁香酸葡萄糖苷、红景天苷、绿原酸、原花青素B2和表儿茶素的峰面积的RSD分别为1.0%、1.1%、0.9%、0.3%、1.2%、1.8%，结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取批号为170615的大血藤样本，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12和24 h按“2.1”项下测定原儿茶酸、丁香酸葡萄糖苷、红景天苷、绿原酸、原花青素B2和表儿茶素的峰面积，结果RSD分别为1.2%、0.7%、0.7%、0.8%、1.2%、0.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验 精密称取同一批的大血藤样本(批号：170615)0.5 g，平行6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，带入标准曲线计算原儿茶酸、丁香酸葡萄糖苷、红景天苷、绿原酸、原花青素B2和表儿茶素的平均质量分数分别为0.050 5、0.569 0、1.500、15.88、2.279、1.705 mg·g-1，RSD分别为1.2%、2.3%、2.5%、1.8%、2.1%、2.4%，结果表明方法重复性良好。

2.7 回收率试验 取重复性试验同批次大血藤约0.25 g，精密称定，平行6份，每份分别精密加入近似等量的6种对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定原儿茶酸、丁香酸葡萄糖苷、红景天苷、绿原酸、原花青素B2和表儿茶素的峰面积，计算回收率及RSD，结果见表3，结果表明该方法回收率良好。

表3 大血藤6个分析物的回收率试验结果(n=6)

2.8 样品含量测定 取不同批次大血藤样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定各批次样品，计算大血藤样品中原儿茶酸、丁香酸葡萄糖苷、红景天苷、绿原酸、原花青素B2和表儿茶素的含量，结果见表4。

表4 大血藤中7个分析物的含量(mg·g-1)

2.9 样品含量聚类分析 运用SPSS 18.0软件处理分析：采用系统聚类法，以6种成分的质量分数为变量，数据转换方式为主成分转换，聚类距离为欧式距离，聚类方法为离差平方和法，对22批大血藤样品进行聚类分析，结果见图2。由图可见，当欧式距离介于10时，22批次样品得以良好的区分，其中以样品2、样品3、样品4、样品5、样品6、样品9、样品11、样品13、样品14、样品17、样品18、样品19、样品20、样品21、样品22聚类为第Ⅰ类，其余的样品1、样品7、样品8、样品10、样品12、样品15、样品16这7个批次聚类为第Ⅱ类。从聚类表型上看，大血藤药材存有两种含量类型，进一步用GraphPad Prism 7软件对这两类(Ⅰ和Ⅱ)的大血藤样品进行含量箱型图统计分析，两种类型6个成分含量的箱型图分布见图3。

3 讨论

3.1 大血藤提取条件的优化 针对本次测定的6种成分，分别考查了回流提取、超声提取，结果发现两者的提取率无明显差异，超声提取法的相对省时、方便、操作误差较小，因此采用超声提取法。另外考察了水、15%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇作为提取溶剂，考查了15、30、45、60 min提取时间和提取次数对6种待测成分提取率的影响，最后确定最佳提取方法为15%甲醇超声提取30 min，提取1次。

3.2 色谱条件的优化 对流动相的选择，考查甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)、50%甲醇-50%乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)、乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，结果显示，乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)系统能使6种待测成分在最短时间达到基线分离，且峰对称性良好，同时也对色谱分离的流速(0.2、0.4和0.6 mL·min-1)及梯度程序进行了优化，最终确定了大血藤色谱分析流动相条件；波长选择，经二极管阵列检测器DAD全波长扫描，原儿茶酸、丁香酸葡萄糖苷最大吸收波长在260 nm，红景天苷、原花青素B2、表儿茶素最大吸收波长在275 nm，绿原酸最大吸收波长在330 nm左右，根据最大吸收响应值，最终选择以260、275、330 nm 作为检测波长。

3.3 样品含量分析结果 中医理论认为大血藤的主要功效为清热解毒，祛风止痛，现代药理研究表明大血藤中有机酸类成分绿原酸和原儿茶酸成分具有抗炎、抗菌作用[13-15]，黄酮类成分原花青素B2、表儿茶素具有抗氧化、抗炎、抗病毒等作用[16-18]；而对于苯乙醇苷类成分的红景天苷，苷类成分丁香酸葡萄糖苷具有抗炎、抗氧化、抑制葡萄糖苷酶活性等[19-22]，6个测定的成分均具有与大血藤传统功效相类似的活性。因此选择原儿茶酸、丁香酸葡萄糖苷、红景天苷、绿原酸、原花青素B2和表儿茶素的6个成分进行同时测定研究。

对于22批不同产地大血藤含量测定结果表明，6种成分含量从均值上来看，绿原酸的含量最高，均值为(10.47±5.18)mg·g-1；其次为原花青素B2，均值在(1.755±0.615)mg·g-1，红景天苷，均值在(1.162±0.900)mg·g-1，表儿茶素，均值在(1.047±0.447)mg·g-1；而丁香酸葡萄糖苷与原儿茶酸的含量均值均低于1 mg·g-1，均值分别是(0.554 5±0.164)mg·g-1和(0.075 1±0.033)mg·g-1。通过系统聚类法，当欧式距离介于10时，22批样品通过得到良好的分类，共聚类成两大类(Ⅰ和Ⅱ类)，通过箱型图比较两类药材6个成分的含量分布情况，可以明显看出类别Ⅱ的绿原酸、红景天苷、丁香酸葡萄糖苷的含量总体箱形分布高于类别Ⅰ，尤其含量最高的绿原酸，在类别Ⅱ型含量显著高于类别Ⅰ(P<0.05)。进一步分析不同产地大血藤，其聚类没有明显地域规律性，有待进一步的研究。

通过聚类模式分析提示不同来源大血藤的品质可能存在较大的差异，建立多成分的质量评价体系可能更有利于反馈大血藤药材内在品质，综上，本试验建立UPLC同时测定大血藤中原儿茶酸、绿原酸、丁香酸葡萄糖苷、红景天苷、原花青素B2、表儿茶素的含量方法快捷，稳定，准确，可以为后期提升大血藤的质量标准提供有效参考。

致谢：本项目在福建省科技厅重点实验室，福建省中药资源研究与开发利用重点实验室完成。