UPLC法测定不同产地白术中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的含量

张文芳，胡梅，陈锦霞，林碧珊

(国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528303)

白术系菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz．的干燥根茎，性温，味苦、甘，具健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎之功，用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等[1]。主产于浙江、安徽，以浙江鄞县、新昌地区产量最大，又以于潜(地处浙江临安附近)所产品质最佳[2]。主要含挥发油、内酯类、有机酸、多糖及其他化学成分[3]。

近年来对白术成分的研究，多集中在挥发油、多糖、内酯等[4～10]。现代研究发现白术中同时含有多种有机酸类成分[11-12]，而植物的酚酸类成分在抑菌、抗感染等方面的报道越来越多[13-14 ]，且可在药物中共同发挥药理活性。白术酚酸类成分的相关报道不多，为保证白术临床使用疗效，本研究建立了同时测定其新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸质量分数的方法，为建立科学、合理、可控的白术活性成分质量控制标准提供科学参考。

1 仪器与试药

Acquity UPLC液相系统(四元低压泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器，Waters公司)；Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Thermo BDS HYPERSIL C18(2.1 mm×50 mm，3 μm)；MS105DU、AL104型电子分析天平 (梅特勒-托利多公司)； KQ-500DE 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Synergy UV型超纯水制备仪(Millipore公司)。

绿原酸对照品(批号110753-201716，质量分数99.3%)来源于中国食品药品检定研究院，隐绿原酸对照品(批号 DST170210-035，质量分数98.0%)、新绿原酸对照品(批号DST180130-015，质量分数99.0%)均来源于成都德思特生物技术有限公司。超纯水由Millipore纯水仪制备；其他试药均为分析纯。15批白术批号及产地来源见表1，经本单位质管部黄国满制药助理工程师检验，结果均符合2015年版《中国药典》规定。

表1 15批白术样品来源信息Table 1 Sources of 15 batches of Atractylodes macrocephalae rhizome

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%(质量分数，下同)H3PO4(B)，洗脱梯度(0～4 min，1%A→6%A; 4～10 min，6%A→9%A; 10～16 min，9%A→18%A; 16～22 min，18%A→20%A; 22～23min，20%A→90%A)；柱温：25 ℃；流速：0.25 mL/min；检测波长：325 nm；进样量：1 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别取新绿原酸和隐绿原酸对照品各10 mg，分别置2个20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用；另取绿原酸对照品10 mg，置20 mL容量瓶中，加甲醇适量，使溶解，精密加入新绿原酸和隐绿原酸对照品溶液各2 mL，用甲醇稀释至刻度，即得。 请明确写出混合对照品溶液中新绿原酸、隐绿原酸的质量浓度。

2.2.2 供试品溶液的制备 取白术样品粉末(过3号筛)约1 g，精密称定，置烧瓶中，精密加30%(体积分数，下同)乙醇20 mL，称定质量，水浴回流40 min，放冷，再称定质量，用30%乙醇补足减失的质量，混匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适应性试验

分别按“2.2”项下方法制备混合对照品、供试品溶液，取空白溶剂，按“2.1”项下色谱条件进样，结果表明，白术供试品溶液中3种酚酸类成分的分离度和理论塔板数均符合要求。见图1。

1.新绿原酸； 2.绿原酸； 3.隐绿原酸。

2.4 线性关系的考察

精密量取混合对照溶液(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸质量浓度分别为0.099、0.983、0.099 5 mg/mL)0.05、0.2、0.25、0.5、1.0、2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得各质量浓度溶液；精密量取各线性溶液1 μL，注入超高效液相色谱仪，分别以峰面积为纵坐标，待测成分质量浓度为横坐标，计算标准曲线的回归方程和相关系数，结果见表2。

表2 3种酚酸类成分的线性关系考察结果 Table 2 The linear relationship of three phenolic acids

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(S1)，按“2.1”项下色谱条件重复进样6 次，记录峰面积。结果测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸峰面积的RSD值分别为0.7%、 0.1%、0.7%，均低于2%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一白术样品(S1)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12 h 各进样1次，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。结果测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸峰面积的RSD值分别为0.5%、0.2%、0.6%，均低于2%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一白术样品(S1)，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下分别进样，测定峰面积并计算质量分数。结果测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的平均质量分数分别为0.067、1.171、0.084 mg/g， 其RSD值分别为0.3%、0.7%、0.4%，均低于2%，表明方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验

取已知质量分数同一批次白术样品(S1)6份，每份约0.5 g，精密称定，分别加入新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品溶液0.6、1、0.8 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，计算加样回收率，结果见表3。

表3 白术中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的加样回收率试验结果Table 2 The results of the recoveries of neochlorogenic acid,chlorogenic acid and cryptochlorogenic acid in Atractylodes macro-cephalae rhizome(n=6)

2.9 不同产地白术药材中3种成分的质量分数测定

取15 批不同产地白术样品，各称取白术药材粉末(过3号筛)约1 g，精密称定，置烧瓶中，精密加30%(体积分数，下同)乙醇20 mL，称定质量，水浴回流40 min，放冷，再称定质量，用30%乙醇补足减失的质量，混匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件测定，计算3种待测成分的质量分数，结果见表4。15批药材的新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的总质量分数在0.19～2.14 mg/g范围内。

表4 15批白术中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的质量分数测定结果Table 4 The contents of neochlorogenic acid,chlorogenic acid and cryptochlorogenic acid in 15 batches Atractylodes macrocephalae rhizomew/(mg·g-1)

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

分别考察了不同检测波长、流动相、柱温、流速、色谱柱对色谱峰分离效果的影响，最终确定色谱条件。

3.1.1 检测波长的选择 通过DAD检测器对供试品溶液在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描，综合考虑3种成分的吸收波长，发现在325 nm波长处各色谱峰的峰面积均较大，因此选择325 nm作为检测波长。

3.1.2 流动相的选择 考察了甲醇-水、乙腈-水，甲醇-0.1%H3PO4、乙腈-0.1%H3PO4为流动相的分离效果，发现在乙腈-水体系下峰形较宽，甲醇-水和甲醇-0.1%H3PO4体系产生的柱压较高，故不进一步考察；乙腈-0.1%H3PO4为流动相时，色谱中各待测成分均能达到很好分离，故确定为洗脱流动相。

3.1.3 柱温、流速的选择 分别比较了柱温为20、25、30 ℃，流速分别为0.20、0.25、0.30 mL/min时的分离效果，结果表明柱温为25 ℃、流速为0.25 mL/min时，分离效果比较好。

3.1.4 色谱柱的选择 考察了Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Thermo BDS HYPERSIL C18(2.1 mm×50 mm，3 μm)2种类型色谱柱，以及3种不同批号Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色谱柱的分离效果，结果显示均有较好的分离度，表明不同色谱柱的耐用性均较好。

3.2 提取条件的优化

分别考察了不同提取溶剂(水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、甲醇、10%乙醇、30%乙醇)、提取方法(回流、超声)、提取时间(30、40、60、90、120 min)对白术中3种成分提取效果的影响，结果显示30%乙醇回流提取40 min效果最佳。

对白术主产区浙江省金华市，河北省保定市，安徽省亳州市、宿州市、宣城市，河南省焦作市，重庆市秀山县，湖南省、湖北省等产区白术中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸进行了质量分数测定，结果表明不同产地白术中3种指标类成分总质量分数差别较大，从高到低分别是河北省保定市(3批均值1.76 mg/mL)>河南省焦作市(2批均值0.86 mg/mL)>安徽省(4批均值0.35mg/mL)>重庆市秀山县(3批均值0.33mg/mL)>浙江省金华市(3批均值0.26 mg/mL)，提示不同产地白术中有机酸类成分质量分数有一定差异。绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸三者结构相似[15]，其药理作用基本一致，故本研究建立的UPLC法同时测定白术中三种酚酸类物质总质量分数，方法简便、准确、可靠，可用于控制白术的质量。