基于UPLC/Q-TOF MS法分析生何首乌药材的化学成分

靳宝芬，叶昊，王凤云，钟艳梅

(1.深圳市宝安区福永人民医院，广东 深圳 518103； 2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006； 3.广东药科大学新药研发中心，广东 广州 510006)

何首乌为蓼科何首乌属多年生草本植物何首乌(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥块根，其味苦、甘、涩，性微温，归肝、心、肾经[1]，主产于广东、广西、河南、湖北、贵州、四川等地[2]。何首乌作为常用的补益类中药，最早记载于《何首乌传》，之后在《开宝本草》等历代本草中均有记载[3]。现代药理研究表明，何首乌中的主要化学成分有黄酮类化合物、蒽醌衍生物、磷脂与苯丙素类化合物等，其特征性成分为二苯乙烯苷类，具有抗感染[4]、抗疲劳[5]、抗衰老[6]、增强免疫力[7]、神经保护[8]、肝脏保护[9]、降血脂[10]、抗动脉粥样硬化[11]等作用。

目前，对何首乌的物质基础及化学成分的研究尚不够全面，阻碍了对其药理作用的深入研究，难以实现对药材质量的综合评价。近年来，液相色谱—质谱联用技术被广泛应用于难挥发性、极性、热不稳定、大分子化合物的分析[12-14]。超高效液相色谱—串联四极杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF MS)具有分辨率高、灵敏度高、选择性高、用时短、扫描范围广等特点，能够快速得出精确的分子质量信息和二级特征裂解碎片离子信息[15-18]。本研究拟采用UPLC/Q-TOF MS技术对生何首乌药材进行全成分扫描与快速鉴定，为生何首乌药材的成分分析提供方法参考，为其进一步开发与利用奠定理论基础。

1 仪器及材料

1.1 仪器与装置

ACQUITY超高效液相色谱分析系统，Q-TOF micro高分辨四极杆与飞行时间串联质谱仪(配有lock-spray接口，美国Waters公司)；Masslynx4.1数据软件处理系统(美国Waters公司)；ACUQITY UPLCTM BEM C18反相色谱柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm，美国Waters公司)；DL-360A超声波清洗器(50 Hz，400 W，上海之信仪器有限公司)；超低有机物型 Arium611 UV超纯水器(德国Sartorius公司)。

1.2 材料与试剂

生何首乌药材购自广州至信药业股份有限公司，经广东药科大学中药学院王凤云老师鉴定为何首乌(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥块根，药材标本保存于广东药科大学中心实验室；大黄素对照品(质量分数≥98%，批号：110756-201512，中国食品药品检定研究院)；2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷对照品(质量分数≥98%，批号：82373-94-2，上海士锋生物科技有限公司)；乙腈(UPLC级，德国Merck公司)；甲醇(HPLC级，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国DIMA公司)；亮氨酸-脑啡肽(质量分数≥95%，批号：L9133-50MG，美国Sigma公司)。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL；柱温：30 ℃；0.1%甲酸水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱(0～3 min，98%～85%A；3～10 min，85%～78%A；10～15 min，78%～50%A；15～20 min，50%～30%A；20～22 min，30%～10%A；22～25 min，10%～0%A；25～30 min，0%～98%A)。

2.2 质谱条件

毛细管电压：3 000 V；锥孔电压：30 V；离子源温度：120 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；碰撞能量：10 V；锥孔反吹氮气流速：50 L/h；脱溶剂氮气流速：500 L/h；脱溶剂气体为氮气；碰撞气体为氩气；负离子模式采集数据，采用Lock Mass通路对实验数据进行实时校正，Lock Mass为脑啡肽(10 mg/L)，负离子模式下高分辨分子离子峰[M-H]-554.261 5，校正切换频率为10次/s，扫描范围为m/z50～1 400。

2.3 供试品溶液的制备

取生何首乌药材5 g，加入90%(体积分数，下同)甲醇水溶液25 mL超声2 h，将何首乌提取液1 mL加于2 mL离心管中，离心5 min(25 ℃，12 000 r/min)，取上清液，即得。

2.4 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，每次进样5 μL，结果各主要色谱峰的保留时间的RSD值均<0.3%，相对峰面积的RSD值均<3%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、12、24 h每次进样5 μL进行检测，结果各主要色谱峰的保留时间的RSD值均<0.3%，相对峰面积的RSD值均<3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验

按规定的色谱条件及质谱条件，分别再次制备供试品6份进样检测，每次进样5 μL，结果对比各主要峰的保留时间的RSD值均<0.3%，相对峰面积的RSD值均<3%，表明方法重复性良好。

3 结果与分析

生何首乌药材供试品在ESI负离子模式下获得了良好的响应值，在30 min内供试品中的化学成分得到有效分离。采用Masslynx4.1软件分析供试品中各化学成分的保留时间及其质谱信息，并结合分子离子峰及文献报道的数据进行对比，再通过与Scifinder、Chemspider等数据库进行峰匹配检索，对其中的化学成分进行分析辨别，最终识别并鉴定了22个色谱峰信号，生何首乌药材供试品在负离子模式下的总离子流图见图1。

图1 生何首乌药材供试品在负离子模式下的总离子流图Figure 1 Total ion current diagram of raw Polygoni Multiflori Radix in negative ion mode

下面以峰6和峰20为例说明分析鉴定过程：

通过软件分析得到峰6的质谱数据，其分子离子峰[M-H]-为m/z405.116 1，预测其分子式为C20H22O9，其二级质谱图及裂解行为见图2，主要特征碎片有m/z243.064 4，是由分子离子峰失去一分子—glu(-162)产生的特征碎片，与文献[19-20]报道的2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷的质谱数据相一致；2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷对照品在负离子模式下的总离子流图见图3，峰6与对照品中峰1的保留时间和质谱数据相一致；因此，推断峰6所对应化学成分即为2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷。

图2 峰6的ESI MS/MS图谱及裂解行为Figure 2 ESI MS/MS map and cracking behavior of peak 6

图3 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷对照品在负离子模式下的总离子流图Figure 3 Total ion current diagram of reference substance of Stibene glucoside in negative ion mode

同理，通过软件分析得到峰20的质谱数据，其分子离子峰[M-H]-为m/z269.043 5，预测其分子式为C15H1OO5，其二级质谱图及质谱裂解行为见图4，主要特征碎片有m/z225.039 7，是由分子离子峰失去一分子—CO2(-44)产生的特征碎片，m/z241.039 3是由分子离子峰失去一分子—CO(-28)产生的特征碎片，与文献[21]报道的大黄素的质谱数据相一致；大黄素对照品在负离子模式下的总离子流图见图5，峰20与对照品中峰1的保留时间和质谱数据相一致；因此，推断峰20所对应化学成分即为大黄素。

图4 峰20的ESI MS/MS图谱及裂解行为Figure 4 ESI MS/MS map and cracking behavior of peak 20

图5 大黄素对照品在负离子模式下的总离子流图Figure 5 Total ion current diagram of reference substance of Emodin in negative ion mode

同理，通过Masslynx4.1软件分析将保留时间、质谱数据及裂解碎片离子信息等与各数据库、文献报道比对，分析及鉴定剩余的20个色谱峰信号所对应的化学成分，各色谱峰信号所对应化学成分的分析及鉴定结果见表1，包括蒽醌类化合物7个，二苯乙烯苷类化合物5个，黄酮类化合物3个，有机酸2个，其他类化合物5个。

表1 生何首乌药材供试品各色谱峰信号所对应化学成分的检测及分析结果Table 1 Detection and analysis results of chemical components corresponding to each chromatographic peak signal of raw Polygoni Multiflori Radix

其中，峰18和峰22所对应的化学成分在生何首乌药材中为首次报道，通过软件分析得到峰18的质谱数据，其分子离子峰[M-H]-为m/z757.179 3，预测其分子式为C39H34O16，其二级质谱图及裂解行为见图6，主要特征碎片有m/z559.109 3，是由分子离子峰丢失一分子—C9H10O5(-198)产生的特征碎片，m/z541.205 8是由特征碎片m/z559.109 3丢失一分子—H2O(-18)产生的特征碎片。同理得到峰22的质谱数据，其分子离子峰[M-H]-为m/z523.137 9，预测其分子式为C31H24O8，其二级质谱图及质谱裂解行为见图7，主要特征碎片有m/z508.245 1，是由分子离子峰丢失一分子—CH3(-15)产生的特征碎片，m/z480.299 0是由特征碎片m/z508.245 1丢失一分子—CO(-28)产生的特征碎片。

图6 峰18的ESI MS/MS图谱及裂解行为Figure 6 ESI MS/MS map and cracking behavior of peak 18

图7 峰22的ESI MS/MS图谱及裂解行为Figure 7 ESI MS/MS map and cracking behavior of peak 22

根据与数据库中的信息比对，峰18和峰22可能的化学结构分别见图8和图9，均为二聚体化学成分。

图8 峰18可能的化学结构Figure 8 Possible chemical structure to peak 18

图9 峰22可能的化学结构Figure 9 Possible chemical structure to peak 22

4 讨论

本研究建立了快速分析生首乌药材化学成分的UPLC/Q-TOF-MS方法，研究结果表明生何首乌药材样本在负离子模式下响应良好，色谱峰得到良好分离。采用Masslynx 4.1对实验数据进行分析，根据各个化合物的高分辨分子量，与数据库、文献报道及对照品谱图比对鉴定，分析鉴定了生何首乌药材样本的化学成分，获得了较好的结果，共分析及鉴定了生何首乌药材中的22种化学成分，包括蒽醌类化合物7个，二苯乙烯苷类化合物5个，黄酮类化合物3个，有机酸2个，其他类化合物5个，其中2种二聚体化学成分(峰18，tR=12.771 min，m/z=757.179 3；峰22，tR=20.997 min，m/z=523.137 9)为首次从生何首乌药材中发现

据文献报道，峰18对应的化学成分曾从蓼科荞麦中被分离出来并被认为具有抗氧化、抗癌、抗感染等功效[23]，此次首次从同为蓼科的生何首乌药材中发现该化学成分，推测生何首乌的抗氧化、抗癌、抗感染等作用可能与该化学成分有关。

通过查阅文献，峰22对应的化学成分曾在蓼科虎杖中被分离出来并被鉴定为有效的PTP1B抑制剂，具有显著的降糖作用，能用于治疗2型糖尿病[24]，此次首次从同为蓼科的生何首乌药材中发现该化学成分，推测生何首乌的降糖作用可能与该化学成分有关，表明生何首乌可能是一种潜在的治疗2型糖尿病的药物。

本研究结果为系统研究生何首乌药材的化学成分及阐述其药效物质基础提供了依据，为进一步解释生何首乌药理药效作用机制提供了理论支撑。