基于UPLC-ESI-HRMSn技术的珍珠荚蒾果实抗肿瘤活性提取物的化学成分分析

梁光平， 王 维， 吴嘉霖， 刘 静， 杨 俊*

(1.遵义医药高等专科学校 药学系， 贵州 遵义 563006; 2.遵义医科大学附属医院 临床医学公共实验中心， 贵州 遵义 563000)

0 引言

珍珠荚蒾果实来源于五福花科荚蒾属植物珍珠荚蒾(Viburnum foetidum var.Ceanothoides，V.Ceanothoides)的果实，具有清热解毒、解表、止咳功效，可用于治疗头痛、感冒、咳嗽、疮毒等[1].荚蒾属植物在我国约有74种，以我国西南地区为分布中心[2].据研究报道，多种荚蒾属植物的果实具有抗氧化[3,4]、抗炎[5]、降血糖[6]、神经保护[4]以及提高谷胱甘肽和促甲状腺激素的水平[7]等作用，且该属植物的根、茎、叶等其他部位因含有丰富的萜类成分而具有较好的抗肿瘤活性[2].只是这些化学成分与药理作用的研究多来源于地中海荚蒾、宜昌荚蒾、南方荚蒾、珊瑚树、欧洲荚蒾、臭荚蒾等荚蒾属植物，而来源于同属植物珍珠荚蒾的研究报道则很少，仅2010年后有个别研究其茎叶化学成分的报道，从中发现包括萜类[8,9]、木脂素[10]、黄酮[8]、甾体以及有机酸[8]等类型的成分数量也不超过30种，其中某些成分对A549、HCT、SK-OV-3等肿瘤细胞株表现出抑制作用[8-10].

此外，本课题组前期[11]也采用气相色谱-质谱法分析了珍珠荚蒾地上部分石油醚提取物的挥发性成分，并从中鉴定了其中的72种，包括40种萜类成分、22种烃类及其衍生物、9种芳香族类成分和1种甾体类成分.随着现代科学技术的发展，UPLC-ESI-HRMSn技术已广泛用于鉴定中药材、中成药制剂的化学成分，加之肿瘤一直以来都是亟待攻克的一大难题，且荚蒾属多种植物的研究都证实具有抗肿瘤作用.为此，本研究采用系统溶剂提取法对珍珠荚蒾果实进行提取，通过肿瘤细胞活性评价筛选活性最好的提取物，借助UPLC-ESI-HRMSn技术分析其化学成分，为进一步挖掘珍珠荚蒾在抗肿瘤方面的药用价值提供研究基础.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料

新鲜珍珠荚蒾成熟果实，于2021年8月委托药农采集于贵州省六盘水市六枝特区箐口乡，经遵义医药高等专科学校梁光平副教授鉴定为五福花科珍珠荚蒾Viburnum foetidum var.ceanothoides 的成熟果实，于55 ℃鼓风干燥3天后使用.UPLC-ESI-HRMSn数据，由贵州省中科院天然产物化学重点实验室分析测试与品质评价中心提供.

1.1.2 主要仪器

U3000-Q Exactive Focus型超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪(Thermo Fisher公司)；CCL-170B-8型二氧化碳培养箱(Esco仪器)；iMark型酶标仪(Bio-Rad仪器)；RV3型旋转蒸发仪(IKA仪器)；BGZ-246型电热鼓风干燥箱(上海博讯).石油醚(60-90 ℃)、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等均为市售分析纯试剂；CCK8检测试剂盒(杭州诺扬生物有限公司).HepG2、A549、Hela、MCF-7细胞由武汉云克隆科技股份有限公司提供.

1.2 实验方法

1.2.1 珍珠荚蒾果实提取物的制备

参照文献[12]的系统溶剂萃取法，取烘干后的珍珠荚蒾果实30 g于圆底烧瓶，依次采用石油醚(60-90 ℃)、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂回流提取3次，每次溶剂用量200 mL，每次提取时间依次为3.0 h、2.5 h、2.5 h，各溶剂三次提取完毕后，合并相应的提取液，减压浓缩回收溶剂，干燥得石油醚提取物(PE，1.83 g)、二氯甲烷提取物(DE，1.06 g)、乙酸乙酯提取物(EE，0.85 g)、正丁醇提取物(NE，1.33 g)，备用.剩余药渣加水煎煮三次，每次用水200 mL，每次提取2.5 h，合并提取物，减压浓缩，干燥得水提取物(WE，1.27 g)，备用.

1.2.2 细胞活性测试

珍珠荚蒾果实5种提取物设置20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、240 μg/mL、320 μg/mL等浓度梯度，按文献[13]采用CCK8法评价5种提取物对HepG2、A549、MCF-7、Hela细胞作用48 h的体外抑制作用.

1.2.3 UPLC-ESI-HRMSn鉴定提取物的化学成分

(1)供试液制备

取珍珠荚蒾果实二氯甲烷提取物3.7 mg，加入二氯甲烷2 mL溶解完全，0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液即为供试液.

(2)液相条件

ACE Ultracore2.5 SuperC18色谱柱(100×2.1 mm).其余条件与文献[14]相同，即流速：0.3 mL/min；梯度洗脱，0～2 min为5%乙腈(0.1%甲酸)-95%水(0.1%甲酸)，2～47 min为95%乙腈(0.1%甲酸)-5%水(0.1%甲酸)，47～50 min为5%乙腈(0.1%甲酸)-95%水(0.1%甲酸).柱温：40 ℃；进样量：5 μL.

(3)质谱条件

离子源：HESI-II.质谱参数设置按文献[14]的条件执行，即正负离子同时采集，扫描100-1 500 Da的质量范围；喷雾电压：正离子3.0 kV；负离子2.5 kV；离子传输管温度：320 ℃.

(4)数据处理

采用优化的UPLC-ESI-HRMSn检测条件采集得到珍珠荚蒾二氯甲烷提取物的数据后，采用赛默飞世尔公司的compound discoverer 3.0软件进行分析，结合软件内的在线数据库、mZcloud或mzVault值以及查阅相关文献数据进行化学成分的推测和鉴定.

2 结果与讨论

2.1 提取物体外抗肿瘤活性筛选结果

从表1的测试结果可知，珍珠荚蒾果实5种提取物对HepG2、A549、Hela、MCF-7细胞均具有不同程度的抑制作用.在5种提取物中，DE提取物对HepG2、A549、Hela、MCF-7细胞的抑制作用均优于其他4种提取物的活性，尤以对Hela细胞的抑制作用最好，IC50达到了116.8±5.35 μg/mL.因此，本研究采用UPLC-ESI-HRMSn技术对DE提取物进行成分分析.

表1 珍珠荚蒾果实5种提取物对4种细胞的抑制作用(n=3)

2.2 UPLC-ESI-HRMSn分析珍珠荚蒾二氯甲烷提取物的化学成分

2.2.1 分析鉴定结果

根据上述UPLC-ESI-HRMSn的数据采集和文献报道的相关数据进行综合分析，从珍珠荚蒾果实的二氯甲烷提取物中鉴定出39种成分，其中包括有机酸12种，萜类10种，苯丙素5种，黄酮4种，香豆素3种以及5种其他化合物.除熊果酸、原儿茶酸已被报道于珍珠荚蒾茎叶外[8]，其他成分均首次从珍珠荚蒾全株植物中被检测到，这进一步丰富了珍珠荚蒾化学成分的研究内容.珍珠荚蒾果实二氯甲烷提取物的正负总离子流图见图1所示.化合物保留时间、相对分子质量、准分子离子峰、二级质谱碎片、mzCloud和mzVault最佳匹配值等信息见表2所示.

图1 珍珠荚蒾果实二氯甲烷提取物总离子流图

表2 珍珠荚蒾果实化学成分UPLC-ESI-HRMSn的鉴别分析结果

续表2

2.2.2 化学成分的质谱分析

(1)有机酸类化合物

由于12种化合物均含有羧基或酚羟基，因此把它们归为有机酸类化合物.它们分别是右旋奎宁酸(1)、曲酸(2)、原儿茶酸(3)、羟基酪醇(4)、扁桃酸(5)、原儿茶醛(6)、对羟基安息香醛(7)、苯甲酸(8)、花椒油素(9)、壬二酸(10)、水杨酸(11)、紫胶桐酸(12).分析它们的质谱裂解规律时发现，化合物1的准分子离子峰为m/z191.055 1[M-H]-，丢失一分子H2O形成碎片离子m/z173.043 9，该离子继续丢失-COOH和-OH后形成m/z111.043 8的碎片离子；化合物2的准分子离子峰为m/z143.033 6[M+H]-，依次丢失H2O、-CH2OH、-CO分别形成碎片离子m/z125.023 2、m/z97.028 7、m/z69.034 2；化合物3的准分子离子峰为m/z153.018 2[M-H]-，丢失-CO2后形成碎片离子m/z109.028 2，这与文献[15]报道原儿茶酸MS/MS裂解规律一致；化合物4的准分子离子峰为m/z153.054 5[M-H]-，连续丢失-CH2OH、-CH2后形成碎片离子m/z123.043 6、m/z109.028 2；化合物5的准分子离子峰为m/z151.039 0[M-H]-，依次丢失-OH、-CO、-CH2OH后分别形成碎片离子m/z136.015 5、m/z107.048 9、m/z77.038 2；化合物6的准分子离子峰为m/z137.023 1[M-H]-，准分子离子峰丢失-CO形成碎片离子m/z109.028 2，准分子离子峰丢失-H2O形成碎片离子m/z119.012 5；化合物7的准分子离子峰为m/z121.028 3[M-H]-，丢失-H、-CO分别形成碎片离子m/z120.020 3、m/z93.033 3；化合物8的准分子离子峰为m/z123.044 2[M+H]+，丢失-OH、-CO分别形成碎片离子m/z105.044 9、m/z77.039 1；化合物9的准分子离子峰为m/z197.080 7[M+H]+，依次丢失-H2O、-OCH3、-CH3形成碎片离子m/z179.069 9、m/z151.038 8、m/z137.059 5，随后再丢失-CO、-OCH3形成碎片离子m/z95.049 4，丢失-OH形成碎片离子m/z79.054 7；化合物10的准分子离子峰为m/z187.096 7[M-H]-，依次丢失-COOH、-OH、-CO形成碎片离子m/z143.096 9、m/z125.096 0和m/z97.064 5；化合物11的准分子离子峰为m/z137.023 2[M-H]-，丢失-COOH形成基准离子m/z93.033 2；化合物12的准分子离子峰为m/z303.217 4[M-H]-，丢失-COOH、-H2O分别形成碎片离子m/z257.211 9、m/z239.201 1，同时，准分子离子峰从分子中部的邻二羟基处裂解分别形成碎片离子m/z171.138 0、m/z129.090 9，m/z171.138 0的碎片离子继续丢失-CO、-COOH后形成碎片离子m/z99.080 4，m/z129.090 9的碎片离子再丢失-CO和-COOH后形成碎片离子m/z85.064 5.

(2)萜类化合物

由于鉴定出的10种化合物的结构均符合异戊二烯法则，因此把它们归为萜类化合物.它们分别是京尼平苷酸(13)、脱落酸(14)、皂皮酸(15)、熊果酸(16)、路路通酸(17)、积雪草酸(18)、甘草次酸(19)、刺囊酸(20)、熊果酮酸(21)、齐墩果酮酸(22).分析它们的质谱裂解规律时发现，化合物13的准分子离子峰为m/z373.113 6[M-H]-，丢失一分子glc和一个OH后形成碎片离子m/z193.049 5，继续丢失-OH、-COO分别形成碎片离子m/z179.055 6和m/z136.015 1，碎片离子m/z193.049 5的倍半萜母核断裂形成m/z113.023 0、m/z101.023 1、m/z89.023 0等碎片离子；化合物14的准分子离子峰为m/z263.127 6[M-H]-，丢失-COO、-OH形成的碎片离子m/z219.138 2、m/z204.114 7与文献[15]报道脱落酸MS/MS裂解规律一致；化合物15的准分子离子峰为m/z487.341 1[M+H]-，二级碎片离子m/z451.319 0、m/z187.147 7、m/z175.147 5、m/z119.085 5与文献[15]报道皂皮酸MS/MS裂解规律一致，同时，准分子离子峰依次丢失-OH、-CO后也分别形成碎片离子m/z469.330 8、m/z441.335 8；化合物16的准分子离子峰为m/z457.255 2[M+H]-，二级碎片离子m/z411.359 8、m/z203.179 3、m/z189.163 4、m/z163.147 7、m/z121.101 1、m/z107.085 6与文献[15]报道熊果酸MS/MS裂解规律一致；化合物17的准分子离子峰为m/z455.2395[M+H]-，丢失-H2O形成碎片离子m/z437.3407，其他二级碎片离子m/z409.346 4、m/z205.158 6、m/z119.085 5、m/z107.085 7与文献[15]报道路路通酸MS/MS裂解规律一致；化合物18的准分子离子峰为m/z487.343 1[M-H]-，连续丢失-COO、-OH后形成碎片离子m/z423.326 5，继续丢失2个-OH和-CH3后分别形成m/z409.310 5、m/z393.315 0、m/z377.285 6；化合物19的准分子离子峰为m/z471.346 5[M+H]-，二级碎片离子m/z425.340 2、189.163 5、119.085 4、107.085 7与文献[15]报道甘草次酸MS/MS裂解规律一致；化合物20的准分子离子峰为m/z471.347 2[M-H]-，继续丢失3个-OH、-CO、-CH3形成碎片离子m/z423.325 6、m/z393.315 0、m/z377.283 1；化合物21的准分子离子峰为m/z455.351 4[M+H]-，继续丢失-OH形成碎片离子m/z437.340 6，其他二级碎片离子m/z409.344 9、m/z205.158 2、m/z175.147 9、m/z121.101 2、m/z107.085 7与文献[15]报道熊果酮酸MS/MS裂解规律一致；化合物22的准分子离子峰为m/z455.351 0[M+H]-，继续丢失-OH形成碎片离子m/z437.340 9，其他二级碎片离子m/z409.347 2、m/z203.179 2、m/z177.163 2、m/z107.085 8、m/z95.085 9与文献[15]报道齐墩果酮酸MS/MS裂解规律一致.

(3)黄酮类化合物

鉴定出的4种黄酮分别是桑黄素(23)、芹菜素(24)、香叶木素(25)、异鼠李素(26).分析它们的质谱裂解规律时发现，化合物23的准分子离子峰为m/z301.035 1[M-H]-，丢失-CO形成碎片离子m/z273.040 4，继续丢失-H2O形成碎片离子m/z255.198 9，碎片离子m/z255.198 9骨架断裂形成碎片离子m/z151.002 5，碎片离子m/z273.040 4黄酮骨架含氧环开裂后形成类似查尔酮结构的碎片离子m/z229.050 8，该查尔酮离子碎片继续断裂形成碎片离子m/z121.028 2，其中m/z229.050 8和m/z151.002 5离子碎片与文献[15]报道桑黄素MS/MS裂解规律基本一致；化合物24的准分子离子峰m为/z269.045 3[M-H]-，丢失-CO形成碎片离子m/z241.050 4，继续丢失-OH形成碎片离子m/z225.054 8，碎片离子m/z151.002 4和m/z107.033 2与文献[15]报道芹菜素MS/MS裂解规律基本一致；化合物25的准分子离子峰为m/z299.055 8[M-H]-，依次丢失-CH3、-CO和2个-OH分别形成碎片离子m/z284.032 3、m/z256.037 2、m/z227.034 3，其他的碎片离子m/z151.002 6和m/z107.012 5均为黄酮和黄酮醇类化合物常见碎片离子，此与化合物23、24的裂解规律一致；化合物26的准分子离子峰为m/z315.050 7[M-H]-，依次丢失-CH3、-CO、-OH分别形成碎片离子m/z300.027 1、m/z271.024 2、m/z255.029 0，其他碎片离子m/z151.002 5、m/z107.012 5均与化合物23、24、25经过相同裂解规律形成，且这些离子碎片与文献[15]报道异鼠李素的基本一致.

(4)苯丙素类化合物

由于鉴定出的5种化合物均具有C6-C3结构单元，因此把它们归为苯丙素类化合物.它们分别是咖啡酸(27)、对羟基肉桂酸(28)、阿魏酸(29)、(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷(30)、松柏醛(31).分析它们的质谱裂解规律时发现，化合物27的准分子离子峰为m/z179.034 1[M-H]-，丢失-CO2形成基准离子m/z135.043 9，继续丢失-CH2和2个-OH形成离子碎片m/z107.048 6、m/z91.053 9；化合物28的准分子离子峰为m/z163.039 0[M-H]-，脱-CO2形成基准离子m/z119.049 0，继续丢失1个-CH2和1个-OH形成离子碎片m/z91.053 9；化合物29的准分子离子为m/z193.049 8[M-H]-，依次丢失-CH3、-OH、-CO、-OH后分别形成碎片离子m/z178.026 3、m/z161.023 3、m/z134.036 1、m/z121.028 0；化合物30的准分子离子峰为m/z519.187 2[M-H]-，丢失一份子葡萄糖形成碎片离子m/z357.133 9，该碎片离子裂解为2分子C6-C3单元后，继续丢失-OCH3、-OH分别形成碎片离子m/z151.038 9和m/z136.015 4，这与文献[15]报道(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷MS/MS裂解规律一致；化合物31的准分子离子峰为m/z179.070 2[M+H]-，丢失-CH3、-OCH3、-CO分别形成碎片离子m/z161.059 3、m/z146.961 1、m/z133.064 6，碎片离子m/z146.961 1继续丢失-CH2、-OH后形成基准离子m/z105.070 1，再连续丢失2个CH2后形成苯环碎片离子m/z79.054 7.

(5)香豆素类化合物

由于鉴定出的3种化合物均具有苯骈α-吡喃酮母核，因此把它们归为香豆素类化合物.它们分别是秦皮乙素(32)、香豆素(33)和7-羟基香豆素(34).分析它们的质谱裂解规律时发现，化合物32的准分子离子峰为m/z177.018 4[M-H]-，二级质谱碎片离子m/z149.023 4、m/z133.028 3、m/z121.028 2、m/z105.033 3、m/z93.033 2与文献[24]报道秦皮乙素MS/MS裂解规律一致；化合物33的准分子离子峰为m/z147.043 9[M+H]-，二级质谱碎片离子m/z119.049 3、m/z91.054 7与文献[15]报道香豆素MS/MS裂解规律一致；化合物34的准分子离子峰为m/z161.023 4[M-H]-，丢失-CO形成碎片离子m/z133.028 3，再依次丢失-O、-CH2、-OH分别形成碎片离子m/z117.033 3、m/z105.033 4、m/z89.038 2.

(6)其它化合物

除上述鉴定的化合物，还检测到去甲升麻素(35)、对甲氧基苯甲醛(36)、5,7-二羟基色原酮(37)、苏木素(38)、5-羟基-四氢萘酮(39)等5种其他化合物.分析它们的质谱裂解规律时发现，化合物35的准分子离子峰为m/z293.099 2[M+H]-，准分子离子峰丢失-OH形成碎片离子m/z275.087 9，继续丢失异戊烯形成碎片离子m/z205.965 5；化合物36的准分子离子峰为m/z137.059 6[M+H]-，准分子离子峰丢失-CH3、-CO分别形成碎片离子m/z122.036 2、m/z94.041 7，准分子离子峰丢失-CO、-OCH3形成碎片离子m/z109.064 9、m/z79.054 7；化合物37的准分子离子峰为m/z177.018 4[M-H]-，依次丢失-O、-CO、-CH3O分别形成碎片离子m/z162.031 6、m/z133.028 3、m/z91.01 7；化合物38的准分子离子峰为m/z301.071 4[M+H]-，丢失-OH形成碎片离子m/z285.039 6，该碎片离子从吡喃环结构断开后分别形成碎片离子m/z165.018 3、m/z121.028 1，m/z165.018 3继续丢失2个CH2后形成碎片离子m/z137.023 2，m/z121.028 1继续丢失3个OH后形成碎片离子m/z77.038 3；化合物39的准分子离子峰为m/z163.074 9[M+H]-，连续丢失-CO、-OH形成碎片离子m/z135.080 2、m/z121.064 7，再连续丢失3个-CH2形成m/z107.085 7、m/z93.070 3、m/z79.054 7等碎片离子.

2.2.3 鉴定成分与提取物细胞活性的关系

本研究采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水等5种溶剂依次对珍珠荚蒾果实进行提取时，由于石油醚在天然药物的提取中主要用于脱脂，珍珠荚蒾果实中存在的多种脂溶性成分此时从药材组织中解离被提取出，当用二氯甲烷提取时，大部分中等极性和中小极性的成分被提取出，这些成分通常都具有多种药理作用.继续采用乙酸乙酯、正丁醇、水进行提取时，由于最有可能具有抗肿瘤作用的中等极性和中小极性成分已被大量提取出，导致在乙酸乙酯、正丁醇、水提取时获得的主要是中大极性和水溶性成分，而这些提取物中可能含有的抗肿瘤作用成分受无效成分含量较高后，对肿瘤细胞的抑制作用下降，这在表1的细胞活性测试结果中得以体现.

与此同时，大量文献报道熊果酸[30-33]、积雪草酸[34]、甘草次酸[35]、芹菜素[36]、异鼠李素[37-39]等三萜、黄酮类化学成分对本研究选取的A549、HepG2、Hela、MCF-7肿瘤细胞以及其他多种肿瘤细胞均具有抑制作用，刺囊酸[40]、路路通酸[41]对MCF-7细胞具有抑制作用，阿魏酸对A549细胞具有抑制作用[42]，秦皮乙素[43,44]对肺、胃、肝、胰腺、肠、乳腺等多器官恶性肿瘤均有治疗作用.然而，右旋奎宁酸、原儿茶醛、花椒油素等多种有机酸类化合物和去甲升麻素、苏木素等其他类成分对肿瘤的抑制作用尚未见直接的研究报道.虽有报道水杨酸衍生物具有抗乳腺癌的作用，但其相关研究成果也尚有争议[45]，这也进一步支撑表1的活性测试结果.据此可初步判断珍珠荚蒾果实二氯甲烷提取物的抗肿瘤物质基础可能是熊果酸、芹菜素、秦皮乙素、阿魏酸等多种成分产生的协同作用.

3 结论

根据体外抗肿瘤活性，珍珠荚蒾果实抗肿瘤活性部位为二氯甲烷提取物，提取物中含有的三萜、黄酮、苯丙素类成分可能是其发挥抗肿瘤作用的物质基础，但还需通过深入研究进行验证.