艰难梭菌耐药性及其机制研究进展

刘霁萱，李咏梅

(北华大学基础医学院，吉林 吉林132013)

艰难梭菌(Clostridium difficile)是一种革兰阳性厌氧菌，广泛存在于自然环境中，常见于动物和人体肠道中，艰难梭菌属于人体肠道的正常菌群。艰难梭菌感染(CDI)是由产毒株艰难梭菌过度繁殖导致肠道菌群失调并释放毒素引起的，被认为是干扰粪便微生物群的直接结果，导致艰难梭菌和毒素表达的过度生长。这与抗生素的使用密切相关。但是，其他几种危险因素也与CDI的发展有关，包括胃酸抑制，高龄，医院暴露以及细胞或体液免疫功能低下[1]。主要临床症状为发热、腹痛、水样便腹泻[2]。

自2002年起发达国家如欧洲、美国等地区多次爆发艰难梭菌感染，患者发病率和死亡率迅速增加。近年来，由于广谱抗生素的大量使用，艰难梭菌的抗药性也逐渐增加，这不仅加重了患者的痛苦，同时也加重患者的经济负担[3]。本文就近年来艰难梭菌耐药性及耐药机制进行详细阐述。

1 艰难梭菌致病机制

1.1 毒力因子

艰难梭菌致病的毒力因子分为毒素性和非毒素性。其中具有毒素性的毒力因子分别为TcdA、TcdB和CDT。TcdA、TcdB均为葡糖基转移酶，可以灭活宿主细胞的GTP酶，破坏细胞骨架，导致细胞的凋亡[4]。除TcdA和TcdB外，一些艰难梭菌分离株，特别是027和078核糖型菌株，还产生二元毒素，也称为艰难梭菌转移酶(CDT),二元毒素可对宿主细胞肌动蛋白进行修饰进而破坏细胞骨架。瑞典的一项回顾性研究得出的结论是，与不分核糖型并且不产生CDT的菌株感染相比，感染CDT的艰难梭菌菌株的人死亡率更高。非毒素性的毒力因子在其致病机制中也发挥着重要作用，目前对其研究涉及到艰难梭菌黏附、定植、免疫逃避、孢子产生有关的一些毒力因子，如纤维素结合蛋白等[5]。它的研究对认清艰难梭菌的致病机制及有关疫苗的研发具有潜在价值。

1.2 毒力相关基因

艰难梭菌毒力菌株的基因组均有一个19.6kb的致病决定区(pathogenicitylocus，PaLoc)，TcdA和TcdB基因均位于致病区域内。除了TcdA和TcdB,PaLoc还编码了另外3个名为TcdR、TcdE和TcdC的基因。TcdA和TcdB在TcdR、TcdC以及TcdE等基因调控下分泌TcdA和TcdB蛋白。TcdA、TcdB以及 TcdR在细菌静止期转录，而TcdC转录发生于对数生长期，TcdR可能对TcdA、TcdB表达发挥促进作用，而TcdC可能发挥抑制作用[6,7]。目前关于tcdE的调控作用尚存在争议，李先平等[8]的研究表明，tcdE与tcdA和tcdB的转录呈正相关，提示tcdE对tcdA、tcdB发挥正调控功能。

2 艰难梭菌对常见抗菌药物的耐药机制

2.1 甲硝唑

甲硝唑是一种硝基芳香药物，它是治疗轻度至中度艰难梭菌感染的首选抗菌药物，大多数临床艰难梭状芽孢杆菌分离株在体外仍对甲硝唑高度敏感。2008年研究发现有12%的临床分离株对甲硝唑表现出异质耐药性并且是可诱导的，而不是由于nim基因的存在[9]。2015年一项研究报告了在以色列传播的对甲硝唑敏感性较低的菌株RT027，它们在以色列造成严重感染，并于2013年在耶路撒冷广泛暴发[10]。这种耐药性是一个多因素过程，涉及不同代谢途径的改变。此外，最近在体外获得的证据似乎表明亚抑制浓度的甲硝唑能够增强RT010菌株的生物膜产量，该菌株对这种抗生素敏感或易感性降低，表明生物膜可能在艰难梭菌对甲硝唑的耐药性中发挥作用[11]。尽管对甲硝唑敏感性降低的机制未完全了解，但我认为，研究甲硝唑敏感性降低对复发性CDI的病理生理学有潜在的影响。

2.2 万古霉素

万古霉素，是用于中度至重度CDI的一线抗生素,由糖基化的六肽链和芳基醚键交联的芳香环组成，在胃肠道中吸收较差。肽聚糖是细菌细胞壁的重要组成部分，其作用机制可抑制肽聚糖的生物合成。在肠球菌和葡萄球菌中经常观察到对万古霉素的耐药性，但在艰难梭菌中则没有如此广泛的传播，耐药机制仍不清楚。但在艰难梭菌中发现了几种类似于Tn 1549的元素[12]，与粪肠球菌中描述的原始Tn 1549元素不同，艰难梭菌的Tn 1549样元素不具有功能性van B操纵子。Ammam F等[13]发现在许多艰难梭菌分离物中发现了一个与粪肠球菌中发现的类似van g的基因簇，尽管该簇基因表达了，但它不能促进对VAN的抗性。已经发现生物膜中的艰难梭菌对高浓度的VAN(20 mg/l)具有更高的抵抗力，并且似乎在存在亚抑制浓度和抑制浓度的抗生素的情况下诱导了生物膜的形成[14]。

2.3 利福霉素和非达索霉素

利福霉素(Rifamycin,RIF)，特别是利福昔明(RFX)，最近已被视为治疗复发性CDI的“追赶者疗法”。非达索霉素(FDX)是一种新型杀菌的窄谱大环抗生素，用于治疗具有高复发风险的CDI。RIF和FDX都是细菌转录的抑制剂，但它们具有不同的RNA聚合酶(RNAP)靶位点。FDX与RNAP的“开关区域”结合，RNAP是与RIF靶标相邻但不重叠的靶标位点[15]。艰难梭菌中的利福霉素类易感性可以通过测试对RIF(一种与RFX相关的利福霉素)的易感性来评估。最近的研究数据表明，11%的艰难梭菌临床分离株对RIF有耐药性，总体耐药率似乎正在上升[16]。

2.4 氟喹诺酮类

氟喹诺酮类药物属于广谱抗生素，与CDI密切相关。菌株027的普遍流行可能与对氟喹诺酮类药物的耐药性有关。在美国和德国，莫西沙星的耐药率约为36%和68%，加拿大莫西沙星的耐药率可高达83%。最近的研究发现，在巴西和以色列，莫西沙星的耐药率分别为8%和4.76%。新西兰，瑞典，中国和法国，对艰难梭菌的氟喹诺酮耐药率在7%至40%之间[17]。细菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要分为：(1)编码基因突变导致药物靶点改变，导致对药物的亲和力降低(2)药物的主动流出增加或通透性降低。Oh H.,Edlund C.[18]研究表明，艰难梭菌对喹诺酮的耐药性是由于DNA促旋酶亚基GyrA和(或)GyrB的变化所致,这些突变可以在喹诺酮耐药性决定区域(QRDR)中发现,T82I是GyrA中最常见的突变位点。D71V，T82V，D81N，A83V，A118V和A118T是GyrB中最常见的突变位点。

2.5 红霉素和克林霉素

对于这一类药物目前各国报道的耐药率均较高，Tickler I.A.等[19]研究报告称，美国30多家医院发现艰难梭菌对克林霉素的耐药率在36%左右。西班牙、波兰和新西兰对克林霉素的耐药率约为74%、65%和61%。在中国、日本、韩国和伊朗克林霉素的耐药率约为73.5%、87.7%、81%和89.3%[17]。这类药物作用于细菌核糖体50S亚基，并通过抑制肽链的延伸，从而对细菌蛋白质的合成进行干扰。临床病原体主要通过核糖体靶标变化或主动外排而对红霉素和克林霉素具有耐药性，而酶的失活也可导致细菌产生耐药性。而且erm基因阴性的艰难梭菌还可以表现出高水平的红霉素耐药性，但是机制尚不清楚[20]。

2.6 四环素

四环素(TET)是一种快速抑菌剂，耐药性在各国之间有所不同，从2.4%到41.67%[21]，四环素可与细菌核糖体30S亚基的轴突起始部分特异性结合，从而防止氨酰基-tRNA与核糖体结合，抑制肽链延长和蛋白质合成。四环素的耐药机制主要与四环素抗性蛋白(tetM)和主动外排系统(tet A，B，C，D等)有关[22]。艰难梭菌主要通过核糖体保护蛋白(tetM)从而对四环素耐药。

3 结语

艰难梭菌的耐药性在世界范围内迅速增长，近年来艰难梭菌感染已成为全球性问题。由于对治疗药物的耐药性逐渐增加，使用这些抗生素的局限性引起了极大的关注，同时需要进一步研究以了解艰难梭菌的耐药机制，这将为预防以及治疗CDI提供新的目标和新的思路。此外，在临床上需要更多地关注艰难梭菌的耐药性，以免盲目使用广谱抗菌药物，需尽量减少艰难梭菌感染的传播和发生次数。