AFP、GP73及miR-221 联合检测对于原发性肝细胞癌的诊断价值

于艳华，王 颖，代芳芳，黄晓婕，娄金丽*

(首都医科大学附属北京佑安医院 1.临床检验中心；2.临床感染中心，北京100069)

原发性肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，由于很多原发性肝细胞癌患者诊断时已经处于晚期导致患者的预后普遍较差。因此，早期发现治疗是良好疗效的关键[1]。多数原发性肝细胞癌早期无症状,使得早期诊断变得困难。分子生物技术的发展确定了许多与肿瘤发生发展密切相关的生物标志物。甲胎蛋白(AFP)是临床应用中最常用的血清学生物标志物，但由于敏感性和特异性较低，临床诊断AFP的准确性不理想，迫切需要更具特异性生物标志物[2]。最近研究发现了其他可能用于早期检测原发性肝细胞癌的生物标志物，包括高尔基体蛋白-73(GP73)、microRNA(miR)等等。然而，血清标志物单独检测原发性肝细胞癌的敏感性和特异性较低[3]。在本研究中，我们探讨了联合AFP、GP73和miR-221检测作为血清生物标志物来提高原发性肝细胞癌的诊断。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2019年9月-2019年12月间确诊的原发性肝细胞癌患者50例(肝癌组),男性患者36例，女性14例；中位年龄53岁；肝硬化组50例，男性39例，女性11例，中位年龄55岁。对照组50例患者中，男31例，女19例，中位年龄50岁。

1.2 样本采集

外周血 3-4 ml在室温下离心 1 300×g 20 min，抽取上层透明微黄的血浆 0.5 ml，加入等量的(0.5 ml)样本保存液中，标本存于-80℃冰箱待测。

1.3 检测方法

1.3.1GP73采用酶联免疫法检测，试剂盒由北京热景生物技术有限公司提供。取出试剂盒和待测样本，在室温(18-28 ℃)平衡至少30 min。分别在相应孔中加入50 μl校准品(S0-S7)和血清样本(空白孔不加)，充分振荡混匀30 s。用封板膜封板后37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤6遍，每次每孔应加入至少300 μl洗涤液，最后一遍洗涤后在干净吸水纸上扣干每孔加入100 μl酶结合物(空白孔不加)，振荡混匀30 s。用封板膜封板后37 ℃温育30 min。再次用洗板机洗涤6遍每孔加入单组份TMB显色液100 μl，振荡30 s，用封板膜封板后37 ℃避光温育10 min。每孔加入50 μl终止液，振荡混匀30 s，使用酶标仪在450 nm波长处测量各孔吸光度值(OD值)。酶标仪无需空白孔调零点。需在终止反应后10 min内进行测定。GP73>3.65 ng/ml为阳性。

1.3.2RT-PCR分析miR-221的表达，试剂盒由骏实生物科技(上海)有限公司提供。Trizol 法提取血清中的RNA在扩增检测区，使用混匀仪将 RP 板 1 200 rpm 混匀 15 秒，然后低速离心 15 s。放入热循环仪，按照以下循环参数进行反转录反应。在放入热循环仪前，始终保持反转录反应液和 RP 板在 2-8℃。在扩增检测区，吸移 75 μl的稀释缓冲液到每个 RP 板反应孔内，稀释反转录产物，使用移液器轻轻吹打 10 次使彻底混匀，注意避免气泡。在 PCR 板(PP)的相应反应孔里加入 9 μl稀释的反转录产物。加样完毕后，用封板膜密封 PCR 板(PP)，在混匀仪上以 1 200 rpm 混匀15 s，然后低速离心15 s。放入 PCR 热循环仪，启动程序。miR-221相对值>3.0为阳性。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 AFP、GP73及miR-221比较

原发性肝细胞癌组患者血清 AFP(阳性参考值：>10 ng/ml、GP73及miR-221水平明显高于肝硬化组和正常对照组，并且有统计学差异(P<0.05)，肝硬化组患者血清 AFP、GP73及miR-221水平与正常对照组比较有统计学差异(P<0.05)，见表1。

表1 3种血清标志物在不同人群检测结果的比较

2.2 AFP、GP73及miR-221单独与联合阳性率比较

原发性肝细胞癌患者血清AFP、GP73及miR-221阳性率分别66%、64%、68%，联合检测阳性率86%，明显高于单项指标检测，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 血清学指标单独检测和联合检测的阳性率比较(例，%)

2.3 AFP、GP73及miR-221单独与联合特异性以及敏感性比较

血清AFP、GP73及miR-221联合检测敏感性为 86.0%，明显高于各个血清标记物单一检测，并且具有统计学差异(P<0.05)；但在特异性方面，3种血清标志物联合检测特异性为69%，低于AFP、GP73及miR-221 单项检测，但没有统计学差异，见表3。

表3 三种标志物单独检测和联合检测肝癌特异性及敏感性比较(%)

3 讨论

原发性肝细胞癌的早期发现和治疗对改善患者预后有重要影响。然而，相当多的肝癌患者在晚期才被确诊，而此时治疗方案也是有限的。临床表现、影像、血清标记物等方法是临床诊断的重要依据。但是，目前临床常用的血清标记物AFP的敏感性和特异性不强[4]。作为肝癌的常规标志物，AFP在肿瘤小于3 cm时常常检测不到或表达水平较低。此外，肝炎肝硬化和慢性肝炎患者中也可以看到AFP水平的升高。因此，迫切需要寻找检测能力更好的新的生物标志物[5]。理想情况下，原发性肝细胞癌的生物标志物应该是高度敏感的肝细胞癌与其他类型的肝脏病变有区别，在早期高水平表达。在我们的研究中，血清AFP、GP73及miR-221联合使用大大提高了原发性肝细胞癌的检测能力。本研究证明，血清AFP、GP73 和miR-221联合检测作为诊断原发性肝细胞癌的生物标志物具有优越性。

GP73又称高尔基体磷酸化蛋白2(GOLPH2)，是高尔基体跨膜蛋白，含400个氨基酸、分子量73kDa的糖蛋白。最近的一些研究表明GP73是最有希望的原发性肝细胞癌血清标志物之一。尽管有研究报道GP73在早期原发性肝细胞癌诊断中的敏感性高于AFP(62%比25%)[6]。但GP73是否优于AFP仍存在争议，有研究表明,GP73是肝癌有价值的生物标志物,并且在敏感性和特异性上优于AFP[7]。他们还发现GP73和AFP联合检测可以进一步提高敏感性。另一项meta分析发现[8]，GP73作为原发性肝细胞癌的独立诊断标志物，与AFP具有可比性。在我们的研究中，结果显示GP73作为独立的标志物与AFP阳性率及敏感性相似。

microRNA 是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA。研究表明 microRNA 参与多种人体调节，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等。人的血浆中存在大量稳定的 microRNA，并且大量研究揭示microRNA 与肝癌发病和预后等具有一定的相关性。与肝硬化、肝炎患者及健康人相比，肝癌患者血浆中的 miR-122、miR-21和miR-223 水平具有显著的差异[9]，miR-221 是近年来发现的原发性肝细胞癌患者血清中会出现明显上调的一类microRNA，提示其可能与原发性肝细胞癌的发生有相关性[10]。其他研究者的结果表明患者血清中 miR-221表达的改变与肝癌患者的生存率具有相关性[11]。这也是我们选择 miR-221研究的原因。本研究显示，AFP、GP73及miR-221 在原发性肝细胞癌患者血清中的阳性率分别为66%、64%、74%，而联合检测提升阳性率达86%，敏感性明显较单项检测高。

综上所述，我们的研究表明，联合AFP、GP73及miR-221作为血清标记物可以显著提高原发性肝细胞癌的检测能力，并且比单独使用任何一个都具有更高的灵敏度，可能成为目前诊断原发性肝细胞癌的一个有价值的补充。对于原发性肝细胞癌的临床诊断具有非常重要的意义。