卷烟SIROX和滚筒烘丝工序烟丝游离氨基酸的变化

赖燕华，陈翠玲，陶 红，王 予，汪军霞，周 瑢

广东中烟工业有限责任公司技术中心，广州市荔湾区东沙环翠南路88 号 510385

在卷烟制丝过程中，烟叶原料需经过加温、加湿、干燥等处理，温度、湿度等条件的变化会引起烟草化学成分的变化，从而对卷烟的感官品质和内在质量产生影响［1-2］。作为美拉德反应的原料之一，游离氨基酸的变化与工艺参数密切相关。因此，研究烟叶游离氨基酸在制丝工序中的变化，有助于了解烟叶在整个制丝过程中的化学成分变化规律，对提高卷烟产品内在质量和保持其稳定性具有重要意义。

目前，有关烟草制丝过程中游离氨基酸含量变化研究的报道较少。刘江生［3］、赖伟玲［4］运用反相高效液相色谱法测定了制丝过程中松片回潮、润叶加料和烘丝3 个工序前后烟丝中的游离氨基酸。张明文等［5］应用离子色谱仪分析了叶丝干燥工序后烟丝游离氨基酸的变化。现有研究报道存在的问题：一是采样缺乏代表性，通常仅在每个工序段选取一个样进行简单比较，结果不具有统计意义；二是检测方法有局限性，色谱分离中烟草待测组分易受其他成分的干扰而被误判。关于烟草中游离氨基酸的检测，国内外多采用气相色谱法［6］、高效液相色谱法［7-9］、离子色谱法［10］、氨基酸自动分析仪法［11］等。气相色谱和高效液相色谱因其定性是通过待测组分在标准样品色谱图和待测样品色谱图中的保留时间对照判定，待测组分和干扰成分共流出的概率很大。离子色谱法和氨基酸分析仪法为行业标准方法，在实际应用中离子色谱法目标氨基酸保留时间容易漂移，且离子色谱法和氨基酸分析仪法同样存在共流出问题，分析过程中均出现对部分氨基酸峰的干扰情况。

叶丝增温增湿和叶丝干燥是叶丝制作工艺中的重要工序，且两个工序均需要对叶丝进行加热。叶丝增温增湿工序的主要目的是提高叶丝温度和含水率，进而提高叶丝的耐加工性。叶丝干燥的工艺目的是降低叶丝含水率并提高叶丝的填充值，满足后续加工需求。本研究中选取制丝生产线上SIROX 增温增湿工序和滚筒烘丝工序前后的烟丝样品，参考黄志等［12］建立的硅烷化衍生-气相色谱/质谱联用（GC/MS）方法，对17 种氨基酸进行分离并在选择离子监测（SIM）模式下进行鉴定，在此基础上，分析SIROX增温增湿工序和滚筒烘丝工序中烟丝游离氨基酸含量变化趋势，旨在为提高卷烟产品内在质量及保持其稳定性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

样品为某一类卷烟牌号制丝线烟丝样品（广东中烟工业有限责任公司广州卷烟厂提供）。

N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA，99%，美国REGIS 公司）；正亮氨酸（内标，99%）、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、酪氨酸和色氨酸（氨基酸标准品，≥99%）（美国Alfa Aesar 公司）；盐酸（质量分数38%，天津永大化学试剂开发中心）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）。

SIROX 增温增湿设备、6 400 kg/h 叶丝滚筒干燥机、9 600 kg/h 叶丝滚筒干燥机（德国Hauni 公司）。7890B-5977A 气相色谱-质谱联用仪（配自动进样器）、DB-5MS 毛细管色谱柱（60 m × 0. 25 mm , 0.25 μm）（美国Agilent 公司）；CP224S 型电子天平（感量：0.1 mg，德 国Sartorius 公司）；Milli-Q Integral 10 超纯水仪（美国Millipore 公司）；Sigma 3-18K 离心机（德国Sigma 公司）。

1.2 方法

1.2.1 工序控制条件

本研究中采样烟丝涉及6 400 kg/h和9 600 kg/h两条生产线。有关两个工序前后烟丝游离氨基酸的变化趋势研究所用数据基于6 400 kg/h 生产线采样烟丝，以9 600 kg/h 生产线烟丝作为对比验证样品。两条生产线的SIROX 和滚筒烘丝工序工艺控制条件如下：

（1）6 400 kg/h 生产线。SIROX 增温增湿工序：入口物料流量：7 000 kg/h；蒸汽流量：380～430 kg/h；出口温度：（79±2）℃。滚筒烘丝工序：入口物料流量：7 000 kg/h；筒内热风风速：（0.17±0.01）m/s；筒 壁 温 度：130～150 ℃；热 风 温 度：（130±3）℃；排潮风门开度：70.0%～90.0%；出口烟丝含水率：12.5%～13.5%；出口温度：（60±5）℃。

（2）9 600 kg/h 生产线。SIROX 增温增湿工序：入口物料流量：7 500 kg/h；蒸汽流量：380～430 kg/h；出口温度：（79±2）℃。滚筒烘丝工序：入口物料流量：7 500 kg/h；筒内热风风速：（0.17±0.01）m/s；筒 壁 温 度：125～145 ℃；热 风 温 度：（100±3）℃；排潮风门开度：60.0%～80.0%；出口烟丝含水率：12.5%～13.5%；出口温度：（60±5）℃。

1.2.2 烟丝取样

对SIROX 增温增湿和滚筒烘丝两个关键工序前后烟丝游离氨基酸的变化进行分析，取样方法如图1 所示。（1）取样点。A：烟丝增温增湿设备入口处，即SIROX 增温增湿工序前的烟丝；B：烟丝增温增湿设备出口处，即SIROX 增温增湿工序后、滚筒烘丝工序前的烟丝；C：烟丝滚筒干燥机出口处，即滚筒烘丝后的烟丝。（2）取样方法。在正常制丝过程中，于A、B、C 处，以90 s 为时间间隔，每次取样150 g，各取样30 次，将30 次取得的样品充分混匀，得到4 500 g 的样本，并从该样本的不同位置上取出烟丝，作为检验样品。（3）取样次数。分3 批次取样，最后得到9 个样本，分别为A1～A3、B1～B3、C1～C3。

图1 取样方式示意图Fig.1 A schematic diagram of the processes and sampling mode

1.2.3 样品制备

按照行业标准YC/T 31—1996［13］制备样品和测定样品含水率。烟丝粉碎后得到的烟末样品于低温（-25 ℃）下保存。

1.2.4 游离氨基酸测定

采用硅烷化衍生-GC/MS 法测定样品中17 种游离氨基酸：丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、酪氨酸和色氨酸。参照文献［12］的方法测定。

（1）样品前处理条件。取出低温下保存的烟末样品，称取0.1 g 烟末置于15 mL 玻璃离心管中，加入5 mL 75%乙醇和100 μL 含内标正亮氨酸（1 mg/mL）的0.1 mol/L HCl 溶液，涡旋振荡1 min。室温下静置16 h，再涡旋振荡1 min，于3 000 r/min下离心3 min，取上清液备用。

（2）硅烷化反应条件。吸取100 μL 上层离心液于样品瓶中，用氮气吹干，然后分别加入100 μL乙腈和100 μL MTBSTFA，涡旋振荡3 min，75 ℃下密闭衍生化反应30 min。冷却至室温，取样进行GC/MS 分析。

（3）GC/MS 条件。色谱柱：DB-5MS 毛细管柱（60 m ×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：280 ℃；进样量：1 μL；分流模式：不分流；柱流速：1.2 mL/min；升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min 的速率升温至140 ℃，再以3.5 ℃/min的速率升温至290 ℃，保持15 min；传输线温度：240 ℃；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；溶剂延迟：16 min；电离方式：EI；电离能量：70 eV；扫描方式：选择离子扫描。

1.2.5 数据分析

采用方差分析（Analysis of variance，ANOVA）考察烟丝经SIROX 增温增湿和滚筒烘丝工序处理后烟丝游离氨基酸含量变化，具体过程：（1）在A、B 两组样品间进行方差分析，氨基酸在两组样品间的差异显著性水平记为P1，若P1＜0.05，则SIROX 增温增湿工序前后氨基酸的差异程度标记为“*”，为突出差异程度，若P1＜0.01，则标记为“**”；（2）在B、C 两组样品间进行方差分析，氨基酸在两组样品间的差异显著性水平记为P2，若P2＜0.05，则滚筒烘丝工序前后氨基酸的差异程度标记为“*”，若P2＜0.01，则标记为“**”。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法分析不同工序点样品的氨基酸含量和组成分布。

2 结果与讨论

2.1 氨基酸检测方法的可靠性验证

将17 种氨基酸的单标标准溶液分别进行硅烷化衍生-GC/MS 分析，结合NIST 谱库检索，确定了每个氨基酸衍生物的保留时间和特征离子，除保留时间稍有不同外，氨基酸衍生物的出峰顺序和特征离子与文献［12］结果一致。将烟丝样品进行硅烷化衍生-GC/MS 分析，并与标样进行比对，样品总离子流色谱图（TIC）见图2。由硅烷化衍生物的特征EI 质谱图可知，该方法具有较好的选择性和特异性。

为确认氨基酸检测结果的可靠性，对氨基酸检测方法进行了方法学验证。结果表明：17 种氨基酸的定量标准曲线线性良好，R2为0.998 9～0.999 9，方法加标回收率为91.4%～113.5%。为进一步验证硅烷化衍生-GC/MS 法测定烟草中游离氨基酸的准确性，对同一烟丝样品采用本方法和YC/T 282—2009 标准方法［11］分别平行测定6 次，因氨基酸分析仪法测定天冬酰胺、谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸5 种氨基酸存在干扰，因此对丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、酪氨酸和色氨酸12 种氨基酸的测定结果进行了比较。为考察两种方法所测结果之间的差异显著性，采用t 检验法［14］对两组结果进行了检验，见表1。采用两种方法分别测定6 次，自由度为10，当置信度为99%（置信水平α=0.01）时，临界值t10为3.17，将计算所得的|t|值与临界值t10相比较。从表1 可以看出，丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸和色氨酸的|t|值均小于临界值t10，表明两种方法的测定结果之间不存在显著性差异；苯丙氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸3 种氨基酸的|t|值大于临界值t10，对于这3 种氨基酸，本方法的测定值略大于标准方法。总体上，本方法较可靠。因此，选择硅烷化衍生-GC/MS 法作为烟丝游离氨基酸的分析方法。

图2 烟丝样品17 种氨基酸衍生物的TIC 图Fig.2 TIC chromatogram of derivatives of 17 amino acids in cut tobacco samples

表1 硅烷化衍生-GC/MS 法与游离氨基酸测定标准方法的结果对比Tab.1 Results of free amino acids by silylation derivatization-GC/MS method and the standard method（μg·g-1）

考虑到烟草中17 种氨基酸的含量差异较大，氨基酸检测结果的稳定性对于加工工序前后烟丝样品的氨基酸含量变化分析至关重要。对于一些含量较低的氨基酸，如果检测结果波动较大，则很难判断样品中氨基酸的变化是由工序引起还是检测方法误差所致。为此，进行了方法重复性考察。取同一烟末样品，平行称取6 份试样，采用1.2节方法进行测试，计算测试结果的相对标准偏差（RSD），结果见表2。可以看出，17 种氨基酸测定值的RSD 在0.7%～4.0%之间，表明方法精密度良好，可以满足实验要求。

2.2 氨基酸检测结果

运用本方法，对A1～A3、B1～B3、C1～C3 等9 个样品进行检测，每个样品平行测定两次，结果取平均值，得到不同工序段烟丝样品氨基酸含量，并计算了3 个批次样品氨基酸含量的相对标准偏差（RSD）。结果显示：在第1 个工序点（SIROX 前），3 个批次样品中17 种氨基酸含量的RSD 值为1.0%～4.4%；在第2 个工序点（SIROX 后/烘丝前），17 种氨基酸含量的RSD 值为0.7%～4.7%；在第3 个工序点（烘丝后），17 种氨基酸含量的RSD 值为0.4%～2.6%。同一工序点、不同批次样品间氨基酸含量差异（RSD≤4.7%）与检测方法造成的差异（RSD≤4.0%）相当，表明不同批次烟丝的一致性较好，所选取的样品可以反映相应制丝工序点的烟丝状态。

表2 氨基酸检测方法精密度测试结果Tab.2 Precision test results for amino acid quantification （μg·g-1）

2.3 氨基酸含量变化趋势

为明确SIROX 增温增湿工序和滚筒烘丝工序对烟丝氨基酸的影响，将A（SIROX 前）、B（SIROX后）和C（烘丝后）3 个关键工序点（图1）所取烟丝样品氨基酸含量以误差棒的形式显示（图3），并采用方差分析对17 个氨基酸组分进行分析。

由方差分析原理可知，当组间差异（制丝工序的影响）远大于组内差异（不同批次样品间的差异），各组间差异有统计学意义。因此，P1＜0.05，表示烟丝经SIROX 增温增湿工序后氨基酸含量发生显著性变化；同样，P2＜0.05，表示烟丝经滚筒烘丝工序后氨基酸含量发生显著性变化。由图3可知：

（1）在SIROX 增温增湿工序前后发生显著性变化（*，P1＜0.05）的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸，其中缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸为极显著变化（**，P1＜0.01）。据文献报道，烟叶在较高温和高湿的环境下调制时，可溶性蛋白质会发生降解，进而导致氨基酸含量的增加［15］。从图3 可以看出，烟丝经过SIROX 增温增湿工序后，丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸含量均呈上升趋势，这可能与该工序较高的温度和湿度有关。

（2）在滚筒烘丝工序前后发生显著性变化（*，P2＜0.05）的氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、组氨酸、酪氨酸、色氨酸，其中丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、酪氨酸为极显著变化（**，P2＜0.01）。17 种氨基酸中，有12 种氨基酸的含量发生了显著性变化，且均呈下降趋势。有研究［5］表明，100 ℃下，大多数氨基酸可与糖发生非酶棕色化反应，并且适当的烟丝含水率（12.5%～13.5%）有利于非酶棕色化反应的发生。在本研究的滚筒烘丝工序中，筒壁温度为125～145 ℃，热风温度（100±3）℃，出口烟丝含水率12.5%～13.5%，这些条件适宜于非酶棕色化反应，而氨基酸参与非酶棕色化反应会导致其含量降低。

为进一步分析氨基酸含量的变化幅度，计算了A、B、C 3 个取样点烟丝样品的氨基酸平均变化量。因17 种氨基酸含量存在数量级差异，为便于比较，变化幅度以相对变化量计，变化幅度=［（工序后值-工序前值）/工序前值）×100%］，结果见图4。从总体上来看：在SIROX 增温增湿工序阶段，丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸6 种氨基酸含量有所增加，增幅介于3.9%～8.3%；滚筒烘丝工序中，缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸5 种氨基酸含量有所降低，降幅介于1.7%～3.0%。氨基酸在两个工序过程中的显著变化趋势，推测可能与蛋白质降解反应和非酶棕色化反应有关。其中在SIROX 增温增湿工序阶段，由于高湿度条件导致烟丝含水率过高，过量水分对非酶棕色化反应有抑制作用［2］，因此该阶段蛋白质降解反应占主导作用，表现为部分氨基酸含量升高；在滚筒烘丝工序，适宜的温度和湿度等条件下部分氨基酸可能发生了一定程度的非酶棕色化反应，因此含量呈现降低趋势。

图3 不同工序段烟丝氨基酸含量变化趋势图（n=3）Fig.3 Variations of amino acid contents in cut tobacco at different process stages（n=3）

图4 6 400 kg/h 制丝线烟丝经过SIROX 和滚筒烘丝工序后氨基酸含量变化Fig.4 Variations of amino acid contents in cut tobacco after SIROX and cylinder drying processes in a 6 400 kg/h primary processing line

为探讨上述烟丝游离氨基酸在两个工序间的变化趋势是否只适用于生产线的特定工艺参数，对同一牌号另一条9 600 kg/h 生产线的烟丝进行了取样分析，分析方法同6 400 kg/h 生产线的烟丝。两条生产线物料流量相差不大，9 600 kg/h生产线热风温度和筒壁温度略高于6 400 kg/h 生产线。9 600 kg/h 生产线烟丝游离氨基酸在SIROX 和滚筒烘丝工序前后的变化情况见图5。可以看出，17种游离氨基酸经SIROX 后含量均呈增加趋势，经滚筒烘丝工序后含量均呈现降低趋势，两条生产线变化趋势一致；两条生产线烟丝游离氨基酸变化幅度不同，但均小于10.0%。可见，在SIROX 增温增湿和滚筒高温烘丝的条件下，烟丝游离氨基酸的变化趋势较为一致。

图5 9 600 kg/h 制丝线烟丝经过SIROX 和滚筒烘丝工序后氨基酸含量变化Fig.5 Variations of amino acid contents in cut tobacco after SIROX and cylinder drying processes in a 9 600 kg/h primary processing line

2.4 3 个工序点烟丝氨基酸的总体轮廓

为进一步了解A、B 和C 3 个关键工序点烟丝中氨基酸组成和含量分布情况，采用主成分分析对9 个样品进行了分析，前2 个主成分因子累计方差贡献率为84%，其中第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）方差贡献率分别为70%和14%，因此提取前2 个主成分概括烟丝氨基酸的总信息量，对样品进行综合评价。9 个样品在第一主成分和第二主成分的空间内投影见图6。可以看出，3 个工序点样品在主成分空间可很好地相互区分开，3 个工序点的样品各自聚为一类，表明3个工序点的烟丝氨基酸组成和含量分布存在明显差异。从A 工序点到C 工序点，烟丝中的部分氨基酸含量先增后降，但其组成和含量未恢复至加工前。

从各氨基酸在第一主成分和第二主成分的载荷（图6）来看，总体上B 工序点的烟丝氨基酸含量高于其他两个工序点；对于A 到C 工序点，两组样品的最大区别在于，A 工序点烟丝中组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、天冬氨酸和酪氨酸含量相对较高，C 工序点烟丝中缬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和甘氨酸含量相对较高。可见，在SIROX 增温增湿工序和滚筒烘丝工序中发生蛋白质降解反应产生氨基酸、非酶棕色化反应消耗氨基酸，但不同氨基酸的反应速度不同，从而导致3 个工序点烟丝的氨基酸含量组成出现差异。

图6 不同工序点烟丝氨基酸的主成分分析双图Fig.6 Principal component analysis bi-plot of amino acids in cut tobacco samples from different process points

3 结论

烟丝经过SIROX 增温增湿工序处理后，丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸6 种氨基酸含量增加，增幅介于3.9%～8.3%。烟丝经过滚筒烘丝工序处理后，缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸5 种氨基酸含量降低，降幅介于1.7%～3.0%。主成分分析结果显示，两个关键工序前后3 个工序点烟丝样品能较好地区分开，表明烟丝经SIROX 增温增湿工序和滚筒烘丝工序处理后，其氨基酸含量和组成发生了明显变化。游离氨基酸的变化与工艺参数密切相关，在后续研究中将继续深化筒壁温度等工艺参数对氨基酸变化趋势的影响研究，以进一步考察制丝过程对烟丝氨基酸的影响。