益肝胶囊对刀豆蛋白A所致小鼠肝损伤JAK2/STAT3信号通路的影响❋

徐 强，高艺书，侯志涛，李东东，韩玉生

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

益肝胶囊是在临床治疗肝损伤经验方的基础上，经过现代工艺制备而成，在改善肝功能和临床症状方面疗效确切。前期实验研究结果表明，益肝胶囊具有抗脂质过氧化、抗炎和抑制HMGB1蛋白表达的药理作用[1-2]。本文研究了益肝胶囊对ConA所致小鼠肝损伤JAK2/STAT3 信号通路的影响，并进一步探讨其对肝保护作用的药理机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级昆明种雄性小鼠50只，体质量(20±2) g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(实验动物生产许可合格证号SCXK黑2013-004)。小鼠经适应性饲养5 d后开始正式实验，在实验期内小鼠均自由饮水及喂食。

1.2 药品与试剂

益肝胶囊由丹参、五味子和苦参按照3∶3∶1比例组成，经过水煎醇提等工艺，由黑龙江中医药大学实验中心制备成胶囊剂型，0.4 g/粒，成人口服每次3粒，每日3次；ConA由美国sigma公司生产；ALT、AST测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)；小鼠IL-6、TNF-а和IFN-γ酶联免疫试剂盒(武汉博士德生物工程公司)；兔抗SOCS-3、p-JAK2 和p-STAT3多克隆抗体(美国CST公司)；BlueRanger 预染蛋白质相对分子质量标准，蛋白质相对分子质量标准(美国 MBI公司)；PVDF 膜(美国Millipore 公司)；ECL Western blot 检测试剂盒、SDS-PAGE 胶电泳试剂(美国 Amresco 公司)；其余试剂为国产分析纯试剂。

1.3 实验仪器

2135型全自动石蜡组织切片机(德国菜卡)；A-6半自动生化分析仪(北京松下技术有限公司)；Moticam3000显微摄影成像系统(美国Motic)； ThermoForma725(美国Forma公司)；DNM-9602型酶标仪(北京普朗新技术有限公司)；凝胶成像系统(以色列MiniLumi公司)；DYY-6C 型电泳仪(北京六一仪器厂)；高速离心机(科大创新)。

注：A.正常组；B.模型组；C.低剂量组；D.中剂量组；E.高剂量组图1 各组小鼠肝组织病理变化及HE染色结果(×400)

1.4 动物分组与给药

50只雄性小鼠随机分成5组，每组10只，即正常组、模型组、益肝胶囊高剂量组、中剂量组和低剂量组。实验开始后，益肝胶囊高、中和低剂量组分别按1.872 g/kg、0.936 g/kg和0.468 g/kg浓度每日灌胃给予益肝胶囊1次，连续给药14 d。正常组和模型组小鼠同时灌胃给予等体积生理盐水。

1.5 模型制备[3]

在末次给药结束1 h后，除正常组外余下各组小鼠采用一次性尾静脉注射ConA(20 mg/kg/只)，制备小鼠急性肝损伤模型。ConA在临用前用无菌PBS溶液稀释成2 mg/ml，正常组小鼠尾静脉注射等体积PBS溶液。各组小鼠在注射ConA后禁食不禁水8 h，然后取材检测相关指标。

1.6 肝功能和细胞因子检测

制备肝损伤模型后8 h麻醉小鼠取外周血，静置1 h后3000 r/min离心15 min分离血清，采用半自动生化仪检测各组小鼠血清中ALT、AST水平。采用ELISA法检测血清中TNF-а、IL-6和I FN-γ水平，操作严格按试剂盒说明书要求进行。

1.7 病理染色

制备肝损伤模型后8 h，麻醉小鼠并取相同部位肝组织，放入10%中性福尔马林固定液固定24 h，再经过脱水、透明、浸腊、包埋和切片，HE染色后显微镜下观察肝组织病理变化。

1.8 Western blot检测

制备肝损伤模型后8 h，麻醉小鼠并取相同部位肝组织，生理盐水漂洗后迅速放入液氮中，然后再放入-80 ℃冰箱中长期保存备用。采用Western-blot法检测肝组织中SOCS-3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表达。DEPC处理并经高压灭菌后的瓷研钵中加入少许液氮，放入0.5 g肝组织充分研磨成极细粉末，然后加入蛋白抽提试剂提取蛋白。采用BCA法进行蛋白定量，调整蛋白浓度，每孔的加样量为20ug，一抗浓度均为1∶4000，二抗浓度1∶10000。扫描底片后采用 Quantity one 软件进行光密度分析, 以目的蛋白条带与内参蛋白条带的光密度白比值来表示目的蛋白的相对含量。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠肝脏病理病理学变化

图1示，正常组小鼠肝组织结构完整，肝细胞板以中央静脉为中心呈放射状排列，细胞染色均匀，无炎细胞浸润和充血等改变。模型组小鼠肝组织结构紊乱，汇管区或肝血窦间可见大量炎细胞浸润，局部可见肝细胞肿胀、脂肪样变或散在点状坏死。益肝胶囊各剂量组小鼠的肝组织结构较清晰，炎细胞数目明显减少，肝细胞肿胀或脂肪样变明显减轻。

2.2 各组小鼠血清ALT、AST和炎性细胞因子水平变化

表1示，与正常组比较，模型组ALT、AST、IL-6、TNF-а和IFN-γ水平均明显增高(P<0.01)；与模型组比较，益肝胶囊给药组ALT、AST、IL-6、和IFN-γ水平均有不同程度降低，高剂量组TNF-а水平均有不同程度降低(P<0.01)，中、低剂量组TNF-а水平比较差异无统计学意义。

表1 各组小鼠血清ALT、AST与炎性细胞因子水平比较

2.3 各组小鼠肝组织SOCS-3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表达

表2图2示，与正常组比较，模型组p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表达明显增高，SOCS-3蛋白表达明显降低(P<0.01)；与模型组比较，益肝胶囊给药组p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表达明显降低，SOCS-3蛋白表达明显增加(P<0.01)。

表2 各组小鼠肝组织SOCS-3、p-JAK2与p-STAT3 蛋白表达比较

注：1.正常组；2.模型组；3.低剂量组；4.中剂量组；5.高剂量组图2 各组小鼠肝组织SOCS-3、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达

4 讨论

肝损伤是临床上肝炎、肝纤维化和肝癌等多种肝病发生发展的共同病理基础，是由于机体内外多种生物或化学因素作用下，引起的肝细胞病理性损伤。目前，损伤后的肝细胞修复及机制是肝病研究的重点和热点。近年来的研究表明, STAT3信号通路的激活在肝损伤修复过程中发挥着重要作用，能够促进肝细胞增殖，调节糖类及脂质代谢和激活肝保护性急性期蛋白表达[4]。

在JAK/STAT信号通路中，JAK2/STAT3信号通路能通过介导多种炎症因子的信号传导，广泛参与肝损伤后的细胞增殖、分化、凋亡等病理过程[5]。在炎症因子的刺激下，JAK2受体发生磷酸化，使JAK2活化并进一步激活STAT3，再通过调节基因转录的方式，介导IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6 等炎症因子的表达；同时，过表达的炎症因子又能够促使JAK2/STAT3的磷酸化进程加快，从而引起炎症级联反应的发生与扩大[6]。研究表明，JAK/STAT信号通路的传导过程受到SOCS蛋白家族的抑制，其中SOCS-3蛋白对JAK/STAT信号通路的抑制作用最强[7]，能够通过抑制JAK2 /STAT3的信号通路来实现抗炎作用[8-9]。

目前，研究人体自身免疫性肝损伤模型中，Con-A所诱导的急性肝损伤模型是比较典型且稳定的动物模型[10]。Con-A 作为一种植物凝集素，能够促进肝组织中T细胞快速增殖、活化，分泌TNF-α、IFN-γ、IL-6等多种免疫细胞因子，同时使血清转氨酶水平快速增高，引起肝细胞大量坏死或凋亡，导致免疫性肝损伤[11-12]。

益肝胶囊对病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝等急慢性肝病有很好的治疗效果，由丹参、五味子和苦参3味中药组成。药理学研究表明，丹参多酚酸盐能够减少炎症细胞因子TNF-α和IL-6的释放，从而对Con A所诱导的小鼠免疫性肝损伤起到保护作用[13]。丹参多糖可以显著降低肝损伤小鼠血清中ALT、AST、NO的活性，减少肝组织匀浆中TNF-α和IL-1β的含量[14]。五味子藤茎木脂素和多糖成分能够通过抗氧化作用，对急性酒精性肝损伤起到保护作用[15]。五味子乙素可通过诱导小鼠肝脏组织中HSP27和HSP70蛋白的表达，对Con A所致的小鼠免疫性肝损伤起到保护作用[16]。氧化苦参碱对ConA 诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用，可能与抑制CD4+IL-17 A 的表达、上调CD4+CD25+FoxP3+Treg 比例、增强机体的抗氧化活性有关[17-18]。

本研究通过Con-A一次性尾静脉注射的方法，建立小鼠急性免疫性肝损伤模型，成功模拟临床免疫性肝病的病理过程，进一步探讨益肝胶囊对免疫性肝损伤小鼠JAK2/ STAT3 信号通路的影响及可能的作用机制。实验结果显示，与模型组比较，益肝胶囊能明显降低小鼠血清中ALT、AST、TNF-α、IFN-γ和IL-6水平，显著减少肝组织中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表达，显著升高肝组织中SOCS-3蛋白表达，明显改善肝组织的病理学损伤。综上所述，益肝胶囊对Con-A所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用与抗炎有关，其机制可能通过上调SOCS-3蛋白表达，调控JAK2 /STAT3 信号通路传导，从而抑制炎症级联反应来实现。