逆灸足三里抗自然衰老大鼠皮肤老化的研究❋

张 苗，纪 峰，陈友义

(福建中医药大学， 福州 350112)

随着人口老龄化日趋明显，衰老成为目前人们研究的热门。衰老被认为是生理功能的衰退或恶化，通常由于基因组的累计变化，端粒长度的减少，蛋白质和细胞损伤，炎症和细胞衰老，内源性干细胞的耗尽[1]，导致皮肤老化的原因很多，包括紫外线(UV)损伤、环境污染、炎症、活性氧的增加以及衰老[2-3]。总的来说，这些不同来源造成的损害会导致表皮组织的退化和损伤以及胶原蛋白和弹性蛋白的丧失，其中衰老也被认为是表皮厚度和生长因子下降的主要原因[4]，同时皮肤衰老与氧化过程也存在关系。

“治未病”是中医基础理论的重要组成部分，对后世影响深远。逆灸是指在机体无病或疾病发生之前，预先应用针灸方法激发经络之气，增强机体的抗病与应变能力，从而防止疾病的发生、减轻随后疾病的损害或保健延年的传统方法。依据疾病预防原则而应用逆灸的手段来“治未病”是针灸学的重要内容。足三里穴是常用的保健要穴，是足阳明胃经的合穴、胃之下合穴、回阳九针穴之一。《针灸真髓》曰：“三里养后天之气，灸三里可使元气不衰，故称长寿之灸。[5-6]”

本实验选取自然衰老大鼠模型，采用目前艾灸动物实验中普遍采用的方法，观察艾灸足三里对皮肤抗老化能力的影响，以期为检验古方、指导临床提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

S-680B全自动凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)；FS-200塑料薄膜封口机(临安铭伟包装机械设备厂)；Mini-PROTEAN® Tetra电泳槽(BIO-RAD公司)；NanoDrop 2000c微量分光分度计(美国ThermoFisher公司)；CKX 41实验室倒置生物显微镜(日本OLYMPOS公司)；SOD和MDA试剂盒(南京建成)；collagenⅠ/Ⅲ抗体(华安生物)；RIPA裂解液(上海生物工程股份公司)。

1.2 实验动物

SPF级SD雌性健康大鼠48只，其中青年组6只，3月龄，体质量(200±20)g；10月龄42只，体质量(400±220)g，按随机数字表法分为10个月、12个月、14个月、16个月对照组以及12个月、14个月、16个月艾灸组，每组各6只；各组动物在同等条件下常规喂食，放置光照充足、通风良好的地方，温度保持在(24±2)℃，湿度保持在40%～60%。

1.3 取穴及艾灸方法

艾灸组每周灸足三里4次，持续2个月、4个月和6个月，对照组每周相同时间抓取但不灸，亦不让其闻到艾灸的味道。

大鼠足三里穴定位参照大鼠标准穴位图谱。足三里位于膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处。艾灸前将穴区直径约1.0 cm左右的鼠毛剪干净，用大鼠固定器将大鼠固定，暴露穴区皮肤。艾柱底盘直径为0.7 cm，艾柱直径为0.1 cm，重1.0 g，将艾柱黏贴在穴区，小孔对准穴位点燃艾柱，每次灸10 min，灸后局部皮肤略红，无发泡。

1.4 取材及标本处理

大鼠于3、10、12、14、16月龄分别取材。取材前1 d用配置的8%硫化钠溶液脱去两肩胛至髂骨之间背部皮肤的毛。第2天大鼠处死后，剪取大鼠背部脱毛皮肤适量分成三部分：第一部分皮肤置于中性多聚甲醛中固定，24 h后常规脱水、透明、封片；第二部分皮肤用预冷生理盐水(4 ℃)冲洗，除净杂质，滤纸拭干，切取皮肤0.5 g放入盛有2.0 mL预冷生理盐水的小烧杯内，剪碎后制成10%匀浆；第三部分用锡箔纸包好放入液氮中，转移至-80 ℃冰箱保存备用。

图1 各组大鼠皮组织H&E染色(×100)

1.5 H&E染色检测皮肤病理变化

将新鲜的皮肤组织浸泡于4%的中性多聚甲醛包埋于蜡块中，切片彻底脱蜡后进行H&E染色。

1.6 ELISA法检测大鼠皮肤匀浆中雌二醇水平

准确称取3、10、12、14、16月龄皮肤质量，按体质量(g)∶体积(ml)=1∶9的比例加入9倍体积的PBS，冰水浴条件下机械匀浆制备成10%的匀浆液，2500～3000 r/min离心10 min，去上清按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.7 皮肤组织MDA含量测量

MDA(丙二醛)是常用的过氧化标志物，在高温和酸性条件下可与硫代巴比妥酸反应生成红棕色的三甲川，其生成物在532 nm 处有最大吸收波长。准备足够多的1.5 mL EP管，按MDA试剂盒说明书进行实验。

1.8 皮肤组织SOD活力测量

SOD(超氧化物歧化酶)是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内如动物、植物、微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标，按SOD试剂盒说明书进行实验。

1.9 qPCR检测多种生长因子表达水平

取各组大鼠皮肤组织，使用Trizon试剂提取皮肤RNA，逆转录成cDNA后进行PCR检测VEGF、EGF、TGF-β、ERβ、bFGF的基因表达水平。引物序列如下：VEGF: F：5’-GCACTGGACCCTGGCTTTACT-3’, R：5’-ACTTCACCACTTCATG GGCTTTCTG-3’； EGF: F：5’-TCGGTGCTGTGCGATTTA-3’, R：5’-TTTCTGGCAGTTCTCCTC-3’； TGF-ß1 F： 5’-ACTACGCCAAAGAAGTCACC-3’，R: 5’-CACTGCTTCCCGAATGTCT-3’; FGF F: 5’-ATTTCCAAAACCTGACCCGAT-3’, R: 5’-TGCCTTTTAACACAACGACCAG-3’。

1.10 Western Blot 检测胶原蛋白表达水平

Western Blot检测胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的蛋白含量：一是清洗玻璃板并安装好，然后灌水检漏、配胶；二是电泳：以浓缩胶电压为70 V和分离胶电压为120 V的条件进行电泳；三是将胶上的蛋白条带转至硝酸纤维素膜上；本是封闭1～2 h后用一抗过夜孵育，然后用TBST洗膜3次，每次10 min，用二抗孵育1～2 h，再用TBST洗膜3次，每次10 min，最后进行ECL化学发光反应。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 艾灸具有保护大鼠皮肤的作用

图1示，组织病理学可以客观真实地反映组织损伤的严重程度。3个月青年组、10个月对照组和12个月、14个月、16个月艾灸组表皮、真皮结构及毛囊完好无损，而12个月、14个月、16个月衰老组大鼠随着年龄的增加，表皮细胞和毛囊上皮细胞肿胀，核固缩，存在充血性血管反应和炎症细胞浸润。

图2示，皮肤马松染色反映皮肤中胶原蛋白的含量，3个月青年组、10个月对照组和12个月、14个月、16个月艾灸组胶原蛋白含量多，排列整齐；12个月、14个月、16个月衰老组胶原纤维性水肿导致排列紊乱，以上结果说明艾灸具有保护大鼠皮肤的作用。

注：箭头所示为胶原蛋白图2 各组大鼠皮肤组织马松染色结果(×100)

2.2 艾灸对皮肤的氧化应激、含水量、雌二醇含量及胶原蛋白表达的影响

表1示，衰老会伴随氧化应激的产生，通过检测抗氧化标志物过氧化物歧化酶(SOD)和氧化标志物丙二醛(MDA)来研究艾灸对氧化应激的影响。艾灸可以增加皮肤中SOD的活力，减少MDA的含量(P<0.05)，说明艾灸可以减少衰老带来的皮肤氧化。

皮肤干湿重比值与皮肤含水量和通透性有很大的关系，皮肤的衰老也会直接导致皮肤含水量下降。表1可知，与衰老各组大鼠比较，艾灸各组大鼠的皮肤含水量显著性增加(P<0.05)，说明艾灸增加皮肤含水量和通透性达到减缓衰老的作用。

皮肤的衰老与雌二醇的下降有很大的关系，通过ELISA检测皮肤匀浆中雌二醇的表达量，从表1可以看出，3个月青年组和10个月对照组的雌二醇含量比较高，随着年龄的增加，雌二醇的含量有显著性下降；而各艾灸组大鼠皮肤的雌二醇含量相比于同月龄对照组有所增加(P<0.05)，说明艾灸可以通过增加皮肤雌二醇含量减缓衰老。

皮肤胶原蛋白的含量也是检测皮肤衰老的一个重要指标，婴儿及青年人皮肤Ⅲ型胶原含量约占70%，Ⅰ型胶原蛋白占30%。当皮肤衰老时，两者比例逐渐倒置，胶原应力传导下降，抗剪切力减弱。通过Western Blot 检测皮肤中胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ的含量，从表1可以看出，3个月青年组和10个月对照组的胶原蛋白Ⅲ含量很高，胶原蛋白Ⅰ含量很少，与各衰老组比较，艾灸可以显著性增加皮肤胶原蛋白Ⅲ的含量(P<0.05)，说明艾灸通过增加皮肤胶原蛋白Ⅲ的含量减缓皮肤衰老。

表1 各组大鼠皮肤组织雌二醇含量、干湿重比值、胶原蛋白含量、SOD活力和MDA含量比较

2.4 艾灸对皮肤中生长因子含量的影响

表2示，皮肤中的生长因子与皮肤衰老也有很大的关系，通过qPCR检测各组大鼠生长因子VEGF、EGF、TGF-β、Erβ和bFGF mRNA的表达水平，3个月青年组和10个月对照组各种生长因子表达量较高，随着年龄的增加生长因子表达量下降；经艾灸治疗的老龄鼠生长因子的表达有所升高(P<0.05)，说明艾灸可以增加皮肤中生长因子的含量。

表2 各组大鼠皮肤组织生长因子mRNA表达水平比较

3 讨论

中医传统理论谓之“美容颜”“好颜色”“健肌肤”“驻颜”“乌须发”“耐老”等。延缓皮肤水牢属于中医“养生”学范畴。中医对皮肤衰老的研究存在以下机理：“以肾为本，注重五脏”“气血津液，密切相关”“六淫七情，亦可致衰”。张仲景在《金匮要略》中提出：“夫治未病者，见肝之病，知肝传脾，当先实脾”。因此，“治未病”应包含未病先防、早期治疗、已病防变等涵义。它的最终目的应是防病防变、保健延年。逆针灸一词首见明·高武《针灸聚英》：“无病而先针灸曰逆。逆，未至而迎之也”。 金晓哲等[14-15]实验结果表明，针刺足三里能提高光老化模型大鼠皮肤组织中SOD的活性，对紫外线照射引起的无毛鼠皮肤光老化具有保护作用。华岩等[16]探讨艾灸足三里穴对小鼠肾脏组织抗氧化损伤的影响，发现能提高骨骼肌组织中GSH-Px、SOD的活性，清除自由基，阻止加快的过氧化反应。白巍等[17]实验表明，针刺足三里、关元穴能明显增强更年期雌性大鼠卵巢组织抗氧化、清除自由基的能力，改善和调节卵巢生理功能，从而延缓卵巢的衰老进程。杨春英等[18]针灸亚急性衰老模型小鼠足三里后，小鼠皮肤组织中的丙二醛(MDA)含量减少，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力增强，羟脯氨酸(Hyp)含量增多，提示针灸足三里穴对小鼠皮肤衰老具有拮抗作用。研究表明[19]，针灸衰老模型小鼠的足三里穴，能提高机体自身抗自由基氧化损伤的能力，减轻淋巴细胞DNA的损伤程度，使小鼠脑组织Bcl-2基因表达上调，抑制细胞凋亡，减少皮肤组织中的丙二醛(MDA)含量，增强谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力，增多羟脯氨酸(Hyp)含量，从而达到延缓衰老的目的。

在现代医学的研究中，皮肤的老化过程中有多种生长因子如VEGF、EGF、TGF-β、FGF等起着重要的保护和修复作用[7]。皮肤衰老研究证实，胶原是人体细胞外基质的主要结构蛋白，胶原纤维约占真皮纤维的90%。研究表明，随着年龄增长，皮肤胶原纤维变细，真皮层变薄。一般婴儿及青年人皮肤Ⅲ型胶原含量约占70%，Ⅰ型胶原蛋白占30%。 当皮肤衰老时两者比例逐渐倒置，胶原应力传导下降，抗剪切力减弱[14]。 胶原蛋白总含量减少，特别是可溶性胶原含量下降明显，同时真皮乳头层和网状层弹性纤维减少及退化，胶原纤维和弹性纤维排列也渐趋紊乱，引起皱纹、松弛及下垂[8-9]。雌激素参与了皮肤的许多生理及病理过程，人类皮肤老化与体内性激素水平降低有关。绝经期出现卵巢周期性排卵及激素周期终止，雌激素下降明显，由原来的0.350 mg/d下降至0.045 mg/d，绝经期妇女由于卵巢的内分泌功能减退，血中雌二醇(E2)水平下降90%，雌酮(E1)下降50%[10]。脱氢表雄酮及硫酸脱氢表雄酮逐步下降，最终导致卵巢基质耗竭(70岁左右)[11-12]。正常皮肤成纤维细胞表达雌激素受体(ER)，雌激素可直接调控该细胞的增殖，提高其活性，增加胶原含量[13]。

本实验在衰老大鼠模型中，利用艾灸进行治疗可以明显缓解老龄大鼠的皮肤衰老。通过H&E和马松染色在组织病理学方面发现，艾灸可以保护表皮和真皮结构以及毛囊的完整性；通过检测SOD活力和MDA含量发现，艾灸在衰老的皮肤中具有抗氧化的作用，抑制氧化应激从而达到保护皮肤的作用；qPCR和ELISA的方法检测大鼠皮肤组织中生长因子和雌二醇的含量。结果发现，艾灸可以有效地增加多种生长因子和雌二醇的含量，说明艾灸通过增加生长因子和雌二醇的含量来延缓大鼠皮肤衰老；最后利用Western Blot方法进一步验证艾灸可以有效地促进皮肤组织中胶原蛋白表达。

综上所述，实验说明艾灸可以降低皮肤的炎症和氧化水平，增加衰老皮肤的胶原蛋白含量和雌二醇水平。本实验艾灸组共分为逆灸2个月、4个月和6个月3组。从实验结果可以看出，逆灸2个月后皮肤的衰老程度具有轻微延缓，逆灸4个月时老龄大鼠皮肤的衰老程度具有显著性缓解，逆灸6个月与4个月无明显变化，说明逆灸4个月就已经足够缓解老龄鼠的皮肤衰老程度，本实验为临床缓解皮肤衰老提供了新的方法与思路。