温润通络法对糖尿病模型大鼠的神经保护作用*

河北中医学院

王 迪 薛思思 姚晓光 杨亦楠 成秀梅 刘 斌△(石家庄 050200)

提要 目的：研究温润通络方对糖尿病(DM)模型大鼠坐骨神经电生理及坐骨神经组织中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)的影响，探讨温润通络法对糖尿病周围神经病变(DPN)的神经保护作用及其部分作用机理。方法：实验动物随机分为空白组、模型组、温润通络方高、低剂量组、血府逐瘀汤组。采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法建立大鼠DM模型，观察大鼠一般状态和坐骨神经形态功能变化，采用荧光分光光度法、比色法和化学法测定醛糖还原酶(AR)活性、Na+-K+-ATP酶和山梨醇(SNS)的表达情况。免疫组化法检测坐骨神经及其周围组织VEGF、bFGF表达。结果：与空白组相比，模型组坐骨神经病变表现为神经纤维肿胀，鞘细胞减少，神经外膜毛细血管扩张充血，炎细胞浸润；模型组大鼠坐骨神经AR活性和SNS含量显著升高(P<0.01)，Na+-K+-ATP酶活性显著降低(P<0.01)；坐骨神经及其周围组织中VEGF、bFGF表达显著升高(P<0.01)；经药物治疗后，与模型组比较，温润通络方高剂量组大鼠坐骨神经AR活性和SNS含量显著降低(P<0.01)，Na+-K+-ATP酶活性升高(P<0.01)，各药物组坐骨神经组织VEGF、bFGF表达均降低(P<0.01)，各中药干预组中，温润通络方高剂量组降低最为显著。结论：温润通络方不仅降低DM大鼠坐骨神经AR和SNS含量、提高Na+-K+-ATP酶活性，还可促进坐骨神经及其周围组织中的VEGF、bFGF表达，说明温润通络法可通过加强对周围神经功能的保护作用而达到改善坐骨神经病变，治疗DPN的作用。

糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病(DM)中的一种最常见的慢性并发症，临床患病率高，也是引起DM患者致残的常见原因[1]，病变累及感觉、运动和自主神经及其周围肌肉组织，主要表现为下肢较为多见的肢体对称性疼痛和感觉异常以及周围神经功能障碍相关的症状。[2]近年来，课题组根据DPN气阴两虚、痰瘀阻滞的病机特点，采用温润通络方治疗DPN取得了较好的临床疗效，然而其对神经组织的保护作用机理尚未明确。现代医学认为其发病机制主要与糖代谢异常引起微血管病变，从而导致神经组织代谢紊乱等多种因素有关。[3]本实验旨在研究温润通络方对DM大鼠坐骨神经组织中糖代谢以及血管损伤的影响，观察温润通络方对DPN的神经保护作用，并探讨其部分作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 采用清洁级健康SD雄性大鼠60只，体质量200～220 g，购自河北医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK冀2003-1-003)，实验动物饲养于清洁级动物实验室，饲养条件：室内温度20℃～24℃，湿度45%～55%，光照12 h左右，自由进食饮水。

1.2 药物及制备 温润通络方[4]水煎剂，药物组成：桂枝、生地黄、女贞子、旱莲草、仙灵脾、白芍等。组成药物均购于石家庄乐仁堂药店，由河北中医学院中药制剂室制备并鉴定，煎煮方法即药物浸泡30 min后用文火煎煮20 min，取汁加水复煎，去渣、过滤、浓缩后，温润通络方高剂量组制成生药浓度为3.4 g/mL以及低剂量组1.7 g/mL的半液体，置冰箱4℃贮存备用。

血府逐瘀汤水煎剂，药物组成：桃仁12 g，红花、当归、生地黄、牛膝各9 g，川芎、桔梗各4.5 g，赤芍、枳壳、甘草各6 g，柴胡3 g。制备方法同上，最后浓缩成含生药浓度为2.56 g/mL的灌胃药液，置冰箱备用。

1.3 主要仪器和试剂

1.3.1 主要仪器设备：光学显微镜，日本OLYMPUS；Neofuge-15R高速冷冻离心机，香港力康生物科技有限公司；EG11508组织包埋机、RM2245石蜡切片机，德国Leica公司；Hymalyzer2000型半自动生化分析仪，德国豪迈公司；930型荧光分光光度计，上海第三分析仪器厂。

1.3.2 主要试剂：链脉佐菌素(STZ)，购自美国Sigma公司；Na+-K+-ATP酶试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；测血糖试剂，购自保定长城临床试剂有限公司；血管内皮生长因子(SC-7269)鼠抗IgG单抗、碱性成纤维生长因子(SC-79)兔抗IgG多抗，均购自Santa Cruz公司。

2 实验方法

2.1 动物分组及处理 适应性喂养7 d后，实验动物随机分为空白组、模型组、温润通络方高剂量组、温润通络方低剂量组、血府逐瘀汤组，共5组，每组12只。除空白组外其余各组参考Schmeichel等的采用STZ腹腔注射的方法建立大鼠DPN模型，即大鼠禁食不禁水12 h后，按50 mg/kg给药剂量一次性腹腔内注射1%STZ枸橼酸缓冲液，72 h后测大鼠尾尖血糖≥16.7 mmol/L即造模成功，空白组则注射相同体积的枸橼酸缓冲液。

各中药组分别采用温润通络方34.0 g/kg·d-1、17.0 g/kg·d-1(为成人临床用药的20、10倍)以及血府逐瘀汤12.8 g/kg·d-1(为成人临床用药的10倍)的剂量进行灌胃，1次/d，共8周。空白组和模型组等体积0.9%生理盐水灌胃。8周末后取材，禁食不禁水24 h，10%水合氯醛(200 mg/kg)麻醉大鼠，断头取血并分离血清存于-20℃，取坐骨神经及其周围组织部分固定于4%多聚甲醛溶液，部分则保存于-80℃待测。

2.2 大鼠一般状态和血糖检测 观察各组大鼠一般状态如毛色、形态、饮水量、进食量、尿量、行为活动等，并采用葡葡糖氧化酶法测定血糖。

2.3 大鼠坐骨神经及其周围组织HE染色 将坐骨神经组织石蜡包埋并切片后，依次放入二甲苯、无水乙醇、梯度酒精溶液中脱蜡至水，蒸馏水冲洗；苏木精复染细胞核，1%盐酸-乙醇溶液进行分化，自来水返蓝；伊红染细胞质；切片依次放入梯度酒精和无水乙醇、二甲苯溶液中脱水透明并封片，显微镜镜检并进行图像采集。

2.4 检测大鼠坐骨神经组织中醛糖还原酶(AR)、Na+-K+-ATP酶、山梨醇(SNS)含量 采用荧光分光光度法检测AR活性，比色法检测Na+-K+-ATP酶、化学法检测SNS含量，严格按试剂盒说明书进行操作。由坐骨神经组织匀浆作为样本，取100 mg坐骨神经组织，清洗后滤干放入1.5 mL离心管并置于冰上，加入1 mL 1×PBS用超声研磨器中研磨，制成匀浆，-20℃过夜后反复冻融2～3次以破坏细胞膜，于4℃，5 000 r/min离心10 min取上清液即可实验。

2.5 免疫组化法检测大鼠坐骨神经及其周围组织中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)蛋白的表达 采用免疫组织化学染色(SP)的方法检测大鼠卵巢及子宫组织中VEGF、bFGF的蛋白分布和表达：⑴石蜡切片脱蜡至水；⑵切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液，微波抗原修复，PBS洗；⑶滴加3%双氧水溶液，阻断内源性过氧化物酶，37℃避光孵育15 min，PBS洗；⑷山羊血清37℃封闭20 min；⑸滴加一抗(抗体稀释比例为1:2 000)4℃孵育过夜；⑹PBS洗，滴加HRP标记的二室温孵育50 min；⑺PBS洗，滴加DAB显色液，光镜观察，当阳性表达为棕黄色终止显色；⑻苏木素复染1～2 min，1%盐酸-酒精分化，自来水洗；⑼切片脱水透明，中性树胶封片；⑽显微镜镜检，Image J软件分析各组光密度值。

3 实验结果

3.1 大鼠一般状态和血糖测定 造模期间，模型组大鼠逐渐出现毛发无泽、行动迟缓、精神萎靡的状态，不仅较空白组饮食量增加，且出现体质量减轻、尿量增加、粪便稀软等症状；各治疗组大鼠的“三多”症状较模型组轻，体质量增加，活动和反应情况均有不同程度的改善，其中以高剂量组症状减轻最为明显，治疗效果最好。此外，与空白组相比，模型组大鼠血糖升高明显(P<0.01)；与模型组相比，血府逐瘀汤组血糖下降不明显，差异无显著性(P>0.05)，温润通络方高、低剂量组大鼠血糖均显著下降(P<0.01)，其中以温润通络方高剂量组血糖最低。与温润通络方高剂量组比较，血府逐瘀汤组和温润通络方低剂量组血糖明显较高(P<0.01)。详见表1。

表1 各组大鼠血糖变化

3.2 大鼠坐骨神经及其周围组织病理改变 如图1所示，正常组大鼠坐骨神经纤维分布排列整齐，形态规整，轴突髓鞘结构清晰完整，单个纤维饱满，鞘壁均匀，可见到Schwann细胞核，长平型，纤维细胞核呈卵圆形。模型组大鼠与正常组比较，神经纤维排列松散紊乱，变细，出现裂隙，密度不均匀，有斑块状密度下降，髓鞘空泡变性，Schwann细胞增殖，轴突萎缩甚至消失，毛细血管管壁增厚，管腔不规则。高剂量组大鼠表现为神经纤维较规则，密度增高，有髓神经纤维结构接近正常，髓鞘脱落较少，髓鞘中可见正常轴突。低剂量组、对照组大鼠坐骨神经表现为神经纤维肿胀，排列松散，有脱髓鞘现象，轴突萎缩甚至消失。

注：A 空白组；B 模型组；C 血府逐瘀汤对照组；D 温润通络方高剂量组；E 温润通络方低剂量组。

3.3 大鼠坐骨神经组织中AR、Na+-K+-ATP酶、SNS含量 与空白组相比，模型组AR和SNS含量明显升高，Na+-K+-ATP酶活性明显降低，差异均有非常显著性(P<0.01)。与模型组相比，温润通络方高剂量组AR明显降低(P<0.01)，温润通络方低剂量组和血府逐瘀汤组差异无显著性(P>0.05)；各治疗组Na+-K+-ATP酶活性均明显升高、SNS含量降低，差异均有显著性(P<0.01，P<0.05)，其中以温润通络方高剂量组各项指标改善最为显著。详见表2。

表2 各组大鼠坐骨神经组织中AR、Na+-K+-ATP酶、SNS含量

3.4 大鼠坐骨神经组织中VEGF、bFGF蛋白的表达 各组大鼠坐骨神经及其周围组织中VEGF、bFGF蛋白相对光密度值的比较：与空白组相比，模型组大鼠坐骨神经组织VEGF、bFGF蛋白水平均明显增多(P<0.01)；与模型组相比，各治疗组VEGF、bFGF蛋白水平均显著降低，差异均有非常显著性(P<0.01)，其中以温润通络方高剂量组最低；与温润通络方高剂量组相比，血府逐瘀汤组、温润通络方低剂量组VEGF、bFGF蛋白表达较高(P<0.05)。详见表3、图3、图4。

表3 各组大鼠坐骨神经组织中VEGF、bFGF 的相对光密度值

注：A 空白组;B 模型组；C 血府逐瘀汤；D 温润通络方低剂量组；E 温润通络方高剂量组。

注：A 空白组；B 模型组；C 血府逐瘀汤；D 温润通络方低剂量组；E 温润通络方高剂量组。

4 讨论

DPN确切的发病机制尚不完全清楚, 普遍认为是代谢紊乱、血管损伤、神经营养因子缺乏、细胞因子异常、氧化应激和免疫等多因素均发挥作用的结果，故西医治疗通过采用降糖、醛糖还原酶抑制剂、抗氧化剂及神经营养等药物改善DPN相关症状。[5]而中医药治疗DPN有其突出的特色和优势，通过对DPN进行辨证分型论治，临床疗效甚佳。DPN属中医属“消渴”日久而致“痹证”“痿证”范畴，本病本虚标实，以阴阳两虚、气阴不足为本，以痰瘀阻络为标。消渴日久，导致气阴不足、阴损及阳，瘀血痰浊阻痹脉络是本病的主要病机[1]，故应用温阳养阴、化痰祛瘀通络的温润通络法治疗DPN。成师在临床上治疗DPN采用温润通络方，取得了很好的疗效，方由桂枝、地龙、白芍、生地黄、仙灵脾、女贞子、旱莲草等药物组成[6]，温而不燥、滋而不腻、活血祛瘀、化痰通络。现代药理学研究表明，温润通络方可多靶点改善糖尿病周围神经病变，其中，桂枝具有扩张血管，促进血液循环，可抗醛糖还原酶活性；地龙有效成分蚓激酶可抑制血小板聚集、防止血栓形成；白芍有降糖、扩血管、清除氧自由基、免疫双向调节等作用；生地黄有降低血糖、强心、止血等作用；仙灵脾改善微循环，增加血流量，降低外周阻力作用；女贞子通常与旱莲草同用，能降血脂、降血糖及抗动脉硬化。[7-10]本实验中，链脲佐菌素腹腔注射建立了糖尿病大鼠模型并成功诱导DPN的形成。温润通络方高剂量组较模型组大鼠一般症状明显好转，血糖下降，轴突萎缩变性等坐骨神经病变明显减轻，均说明温润通络方对DM大鼠坐骨神经病变的修复作用明显。

DPN的发病与糖代谢引起的神经细胞代谢异常关系密切，其机制与多元醇代谢增强有关。AR是多元醇代谢的关键酶，高血糖使其活性增高，通过激活多元醇通路使细胞内SNS生成蓄积，继而神经纤维渗透压上升，Na+-K+-ATP酶活性下降，导致神经细胞代谢与功能损害, 最终引发神经纤维病理性损伤，[11-12]如周围神经节段性脱髓鞘、轴突变性坏死，血管和神经细胞功能障碍及组织结构改变，最终参与DPN的发生和发展。本实验结果显示，模型组大鼠AR和SNS含量升高，Na+-K+-ATP酶活性降低，DPN出现多元醇代谢紊乱；经温润通络方治疗，AR、SNS含量降低，Na+-K+-ATP酶活性升高，说明温润通络法可通过改善神经细胞多元醇代谢紊乱，缓解局部症状。

神经营养因子(NTFs)由组织和胶质细胞产生的一类能促进神经细胞存活、生长、分化的蛋白质因子，有多种生物学效应，目前认为其合成、分泌、代谢障碍均参与DPN的发病机制。[13-14]在神经祖细胞发育成神经元的过程中, bFGF参与神经元前体细胞增殖和最初分化，[15]神经元释放到靶组织中的神经生长因子(NGF)，通过bFGF而诱导NGF与受体结合后，通过轴索逆向转运进入细胞体，可减少神经变性、刺激轴突生长，抑制神经元凋亡，促进神经再生和修复。[16-17]故内源性bFGF表达增多是外周神经损伤后的早期的修复反应，本研究中模型大鼠bFGF代偿性增多，说明此时神经细胞已发生损伤，温润通络方能下调bFGF蛋白在坐骨神经中的表达，说明温润通络法可减轻bFGF代偿性增多的现象。

此外，有研究表明，VEGF亦被认为是一种神经营养因子。[18]作为促血管内皮细胞有丝分裂因子，有促轴突延伸、增加神经元、雪旺氏细胞存活率、促进神经再生、神经内血管形成等神经保护作用。生理条件下，VEGF在正常成熟神经组织中不表达或少表达；然而，在缺血、缺氧、外伤、神经系统脱髓鞘及代谢异常等病理情况下，神经组织VEGF及其受体表达显著增高。在本实验研究中，DPN大鼠坐骨神经纤维中VEGF蛋白表达出现代偿性增加，笔者的研究和以往的报道结果一致，[19]说明VEGF可在高糖环境下，发挥营养因子的保护作用；经温润通络方治疗后，VEGF蛋白表达较模型组降低，说明温润通络法对神经组织有一定保护作用。

DPN发于消渴，其发生发展与肝、脾、肾三脏关系密切，阴虚燥热是消渴的基本病机；消渴日久，燥热灼津为痰；痰阻脉络、阴损及阳，阳气不能温煦四末，气不行血，血瘀脉络阻滞，故表现为肢体麻木、疼痛，肢凉不温等症。因此，论治消渴病的并发症周围神经病变采用温润通络治法，以温润为主，温阳养阴、活血祛瘀、化痰通络。综上所述，温润通络方不仅降低DM大鼠坐骨神经AR和SNS含量提高Na+-K+-ATP酶活性，促进坐骨神经及其周围组织中的VEGF、bFGF表达，说明温润通络法可调节神经细胞多元醇代谢，加强对周围神经功能的保护作用而改善坐骨神经病变，缓解局部症状，达到治疗DPN的作用。