内江猪保种场种母猪肺炎支原体检测

陈谦，吕云龙，林芳卉

（1.内江市种猪场，四川 内江 641007；2.西南大学动物科学学院，重庆 荣昌 402460）

猪支原体肺炎（MPS），是由猪肺炎支原体感染猪引起的一种呼吸道传染病。临床上主要表现为咳嗽、被毛粗乱、呼吸加快、生长发育受阻、饲料转化率低等。特征性病理变化为猪肺部出现“对称性虾肉样变”。单纯猪肺炎支原体感染的死亡率一般不高，但通过抑制肺部免疫可以引发潜伏性、慢性支气管肺炎，继而被细菌、病毒等感染，在很大程度上促进了猪呼吸道疾病综合症的发生，给规模化养猪场的猪群带来严重的危害［1］。因此，控制猪场猪支原体感染是保证猪群健康的重要一环。

为了解内江猪保种场种母猪肺炎支原体的感染情况，本试验采集内江猪保种场未免疫种母猪的血液95 份，并分离血清，用ELISA 方法检测猪肺炎支原体抗体；同时采集未免疫种母猪的鼻拭子95 份，提取猪肺炎支原体DNA，进行猪肺炎支原体PCR扩增，了解保种场种母猪肺炎支原体的带菌情况［2-8］。根据两种检测结果，结合繁殖性能情况拟定淘汰计划，为保种场猪肺炎支原体的防制提供科学依据。

1 材料

1.1 被检鼻拭子 随机选择未免疫的种母猪，用PBS 润湿无菌棉签，将棉签以45°左右插入猪鼻孔，轻轻旋转，刺激猪打喷嚏，2个喷嚏过后，轻轻拔出棉签，放入1.5 mL装有PBS的离心管中，密闭冰袋保存，置-20 ℃冰箱中备检［9］。

1.2 被检血清 随机选择未免疫的种母猪，前腔静脉采血3～5 mL，室温静置，待血清析出后，离心管3 000 r/min 离心10 min 分离血清，取上清液于-20 ℃保存待检。

2 试验方法

2.1 鼻拭子PCR检测

2.1.1 引物合成 采用李石等［10］报道的猪肺炎支原体P97基因，合成引物，片段大小为1 173 bp，引物序列分别如下：

上游引物：5′-TTGGTCTAACTGTCGGACTT-3′；下游引物：5′-CGCTTGCTGCATCTAGGCTATAT-3′。

送上海生工生物公司进行合成。

2.1.2 猪肺炎支原体DNA 的提取 严格按宝生生物工程（大连）有限公司生产的细菌基因组提取试剂盒说明书进行。

2.1.3 PCR反应体系及条件 猪肺炎支原体P97基因PCR扩增反应体系及条件见表1。

表1 PCR反应体系及条件 μL

2.1.4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 5倍TBE缓冲液：450 mmol/L Tris-硼酸，10 mmol/L EDTA，pH 值8.0。使用时将其稀释10 倍至0.5×TBE 缓冲液，可同时作为电泳及制胶用的缓冲液。根据制胶量及凝胶浓度标准制胶，取适量样品与6×上样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110 V，电流在40 mA以上。当条带移动到距凝胶前沿约2 cm 时（耗时约40 min），停止电泳，在凝胶成像系统中拍照并观察结果。

2.2 血清ELISA抗体检测 操作方法、结果判定严格按上海酶联生物科技有限公司生产的猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒进行。

3 试验结果

3.1 种母猪鼻拭子猪肺炎支原体P97 PCR扩增结果 通过PCR 扩增，得到与P97 大小相符的核酸片段，为1 173 bp。在95份鼻拭子中，有5份为阳性，阳性率为5.26%。详见表2。

表2 种母猪肺炎支原体PCR及ELISA抗体检测结果

3.2 种母猪肺炎支原体血清ELISA 抗体检测结果 用ELISA 方法检测95 份未免疫种母猪的肺炎支原体血清抗体，结果有40 份阳性，55 份阴性，阳性率为42.10%。详细结果见表2。

4 分析与讨论

4.1 根据猪肺炎支原体P97 基因保守序列设计的引物对猪肺炎支原体进行诊断，克服了猪肺炎支原体培养困难、血清学检测中猪肺炎支原体与猪鼻支原体易发生交叉反应的缺点，可见通过P97基因PCR诊断猪肺炎支原体是一种十分可靠的方法。本试验采用PCR 法检测了内江猪保种场未免疫母猪的鼻拭子95 份，结果显示鼻拭子PCR检测猪肺炎支原体的阳性率为5.26%。有报道用PCR方法对303份鼻拭子样品进行猪肺炎支原体检测，结果阳性率为12.5%。本试验与上述报道相比，阳性检出率较低，其原因可能是随着猪肺炎支原体感染日期的增加，感染猪不排菌或者猪鼻排出的猪肺炎支原体达不到检测的量。武昱孜等［11］用PCR 检测方法对72 份支气管肺泡灌洗液进行了猪肺炎支原体检测，阳性率为58.33%；马晓迪等［12］用PCR 检测方法对550 份支气管肺泡灌洗液进行了猪肺炎支原体检测，阳性率为50%。从上述报道结果看，猪肺炎支原体在支气管肺泡灌洗液中的检出率均比鼻拭子中的高。由此可以看出，虽然鼻拭子PCR在猪早期感染时具有一定作用，但是受制于感染日期和采样部位，可能导致漏诊。因此，鼻拭子PCR 用于猪肺炎支原体诊断时应与其他方法结合进行。

4.2 本试验采用ELISA 对95 份未免疫种母猪的血清进行抗体检测，结果显示感染率为42.1%。杨莉等［13］对贵州省六个地区13 327 份样品进行猪肺炎支原体血清学调查，结果感染率为30%；师丽敏等［14］对海南省海口市部分地区的212份血清样品进行猪肺炎支原体抗体检测，结果阳性率为50.6%；李石等［10］对新疆北疆地区456 份样品进行猪肺炎支原体血清学调查，结果感染率为50.44%。上述报道与本试验结果基本一致，说明内江猪保种场的种母猪感染肺炎支原体比较严重，需进一步采取防控措施。

4.3 本试验中鼻拭子PCR检测阳性率为5.26%，血清ELISA 抗体检测阳性率为42.1%，两种检测方法的结果差异较大，ELISA 抗体检测阳性率明显高于PCR，究其原因可能与猪感染肺炎支原体后随着抗体的产生，机体内肺炎支原体逐渐被清除有关；另外一个原因是随着感染日期的延长，猪肺炎支原体从鼻咽部迁移到支气管乃至肺泡内，因此鼻咽拭子的检出率较低。这也与有关文献报道的猪肺炎支原体在支气管肺泡灌洗液中检出率最高相符合［15-16］。