关岭自治县关岭牛瑟氏泰勒虫的分子生物学检测及不同季节感染率统计

冯明祥，图 雅，徐 雨，韦登雄，刘 苹，陈 颖，杨和俊

(贵州省关岭布依族苗族自治县动物疫病预防控制中心，贵州关岭561300)

关岭牛是国家级重点保护的78个地方畜禽品种之一，以出肉率高、蛋白质含量高、繁殖率高、脂肪含量低等特点而闻名[1]。关岭牛产业是关岭自治县近年来的重点发展产业。牛血液原虫，如附红细胞体(Eperythrozoon)、泰勒虫(Theileria)、巴贝斯虫(Babesia)、伊氏锥虫(Trypanosoma)等感染可导致间歇热、贫血、消瘦、黄疸、血红蛋白尿、水肿及神经症状，甚至死亡，严重阻碍养牛产业的健康发展[2～5]。形态学诊断法是传统的血液原虫诊断方法之一[2，6]，但需要鉴定人员具有很好的寄生虫形态学知识及相应的鉴定经验，并且无法鉴定寄生虫亚种。

近年来兴起的分子生物学诊断方法不仅可以鉴定虫种，还能用于寄生虫的流行病学调查。泰勒虫表面主要蛋白(MPSP)是主要的免疫显性蛋白，在寄生虫进入宿主红细胞阶段，该蛋白在寄生虫表面合成[7]。由于MPSP基因序列具有显著的种属差异，已广泛用于泰勒虫的亚种鉴定[5，8]。关岭牛易受蜱虫叮咬而感染血液原虫[9]。本试验通过分子生物学方法对关岭牛瑟氏泰勒虫进行检测，并统计不同季节的感染率和流行规律，为有效防控该病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血液样品采集关岭自治县12个乡镇规模养牛场的关岭牛血液样品262份(夏季157份，冬季105份)作为检测血样。

1.1.2 主要试剂2×TaqMaster Mix试剂，购自康为世纪生物科技有限公司；DNA Marker DL 2 000(TaKaRa)、GoldView核酸染料(Solarbio)、天根DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒，均购自北京诺博莱德科技有限公司。

1.1.3 主要仪器伯乐T100梯度PCR仪(购自北京佳源兴业科技有限公司)、JS-680D凝胶成像系统(购自上海培清科技有限公司)。

1.2 方法首先将顶云街道办同富养殖场的3号样品通过PCR扩增、测序及序列分析后进行虫种鉴定。其余样品以此作为参照进行PCR扩增即可判断感染情况。

1.2.1 血液样品DNA提取根据天根DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行血液基因组DNA提取。

1.2.2PCR扩增及凝胶电泳合成MPSP基因上游引物序列：5’-TCGCCCACAGAATGAAGCAT-3’；下游引物序列：5’-CCAAAGGCCAAGCACCTGTTC -3’。预扩增片段492 bp。PCR反应体系25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，DNA模板0.3 μL(采用0～10 μL移液枪)，ddH2O 11.8 μL。扩增条件：预变性95 ℃ 5 min，变性94 ℃ 45 s，退火60 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 50 s，共35个循环；再延伸72 ℃ 10 min，PCR产物 4 ℃保存。同时设阴性、阳性对照各1份。分别取PCR产物6 μL，加样于10 g/L TBE琼脂糖凝胶点样孔中进行凝胶电泳，在凝胶成像系统观察结果。

1.2.3 扩增产物的测序及序列分析回收基本符合预期片段大小的PCR产物，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI数据库中进行BLAST序列比对，建立系统进化树以确定虫种。

1.2.4 不同季节关岭牛瑟氏泰勒虫感染率统计分别对夏季和冬季的样品进行瑟氏泰勒虫感染率统计。计算方法：感染率(%)=单个乡镇感染样品数/单个乡镇采集样品数×100%。

2 结果与分析

2.1PCR扩增产物凝胶电泳结果由图1可见，扩增产物条带清晰，无其他杂带，与预期扩增片段(492 bp)基本相符(命名为GLT)。

2.2 系统进化树的建立及分析扩增产物经生工生物工程(上海)股份有限公司测序确认为 485 bp片段，将该片段序列与NCBI数据库中的数据进行BLAST比对，以环形泰勒虫(T.annulata)表面抗原Tams1基因序列为外群(登录号：Z48738)，以瑟氏泰勒虫(T.sergenti)[登录号分别为：MF996372(羊，中国)、MG664538(黄牛，中国)、D87190(黄牛，韩国)、D87193(黄牛，日本)]、东方泰勒虫(T.orientalis)(黄牛，越南，登录号：AB560822)、水牛泰勒虫(T.buffeli)(水牛，中国，登录号：AF236096)、未定种泰勒虫(T.sp.OK3)(黄牛，日本，登录号：D87205)为参考虫株构建系统进化树。用MEGA5.1程序中的最大似然法(ML)，选用Kimura2-parameter模式绘制系统进化树，采用自展检验(bootstrap test)估算所构建系统树的可靠性，复制数均为1 000。基于MPSP基因构建的种系进化树分析表明，GLT与瑟氏泰勒虫中国参考株MF996372、MG664538聚为1支，与其他参考株在不同分支上，可判定GLT为瑟氏泰勒虫中国株基因片段。

2.3 不同季节瑟氏泰勒虫感染率以GLT扩增片段作为参照，经PCR检测，夏季血液样品共检出8份阳性样品，有6个乡镇的牛场感染瑟氏泰勒虫，平均感染率5.10%。岗乌镇养牛场感染率最高，为16.67%。冬季血液样品共检出1份阳性样品(花江镇养牛场)，平均感染率0.95%。见表1、表2。

表1 各乡镇关岭牛瑟氏泰勒虫夏季感染率统计

表2 各乡镇关岭牛瑟氏泰勒虫冬季感染率统计

3 结论与讨论

3.1基于MPSP基因序列的遗传进化树分析发现，检测样品GLT的基因序列与瑟氏泰勒虫中国参考株MF996372、MG664538聚为1支，与其他参考株在不同分支上，该基因片段能够特异性地用于瑟氏泰勒虫的虫种鉴定及流行病学调查参照。

3.2通过对262份血样进行检测发现，关岭自治县关岭牛瑟氏泰勒虫全年的平均感染率为3.44%，其中夏季感染率(5.10%)明显高于冬季(0.95%)，说明瑟氏泰勒虫的感染与气候变化及传播媒介蜱的季节性活动有关。此外在采样时通过询问了解，所有乡镇均没有使用过针对血液原虫的药物进行驱虫。

3.3相比于环形泰勒虫，许多地方对瑟氏泰勒虫的关注度不高，应引起足够重视。对于瑟氏泰勒虫的治疗目前常用贝尼尔(血虫净)：按每千克体重3.5～5 mg，用灭菌蒸馏水配成5%溶液，臀部肌肉深部注射，轻症1～2次即可；重症应进行2个疗程，第1疗程3次，每次间隔24 h，停药2 d，第2疗程连续用药2次。也可用阿卡普林(硫酸喹啉脲)：每千克体重用1 mg，配成1%～3%溶液(现配现用)，颈部皮下或肌肉注射，隔日注射1次，一般用药2次效果较好，严重病例也可用3次。