一株鸭源鸡杆菌的分离鉴定及药敏试验

陈国权，王 娜，张 旭，赵大杰，阎朝华，周碧君，3*，王开功，3，程振涛，3，文 明，3*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025； 2. 贵州大学动物疫病研究所，贵州贵阳550025；3. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州贵阳550025)

鸭源鸡杆菌(Gallibacteriumanatis)属于巴氏杆菌科，鸡杆菌属，是1种定殖于禽类上呼吸道和下生殖道的条件致病菌[1，2]。主要感染鸡、鸭、鹅、火鸡等，输卵管是其主要靶器官，常引起腹膜炎、输卵管炎、卵巢炎、输卵管囊肿等疾病，导致开产蛋鸡产蛋量和蛋品质下降，死亡率上升，是影响养禽业的1种重要病原菌，给养禽业造成严重的经济损失[2，3]。2019年11月初，贵州省六盘水市钟山区某蛋鸡养殖场的开产蛋鸡(品种为乌蒙凤鸡)表现腹膜炎和输卵管炎症状，产蛋率下降，疑似鸭源鸡杆菌感染。为确诊发病原因，本试验通过细菌分离培养、生化试验、16S rRNA基因鉴定及序列分析进行诊断，并通过药敏试验指导临床用药，为贵州省鸭源鸡杆菌病的临床诊断和防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 检测病料选取临床发病的130日龄开产蛋鸡6只，无菌采集心脏、肝脏、脾脏组织作为检测病料。

1.2 主要试剂2×TaqPCR MasterMix[购于天根生化科技(北京)有限公司]，DL 2 000 DNA Marker[购于宝生物工程(大连)有限公司]，Gel Extration Kit胶回收试剂盒(购于Omega公司)，革兰氏染色液(购于北京索莱宝科技有限公司)，麦康凯琼脂培养基、TSB培养基、微量生化鉴定管、药敏纸片(购于杭州微生物试剂有限公司)，新生牛血清(购于浙江天杭生物科技有限公司)，鲜血琼脂培养基(贵州省动物疫病研究室自制)，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 细菌分离培养无菌接种病鸡的心脏、肝脏、脾脏组织于鲜血琼脂培养基，置于37 ℃恒温培养箱培养16～24 h，观察菌落生长情况。无菌挑取单个呈β溶血的优势菌落分别接种于鲜血琼脂培养基进行纯化培养和麦康凯培养基进行鉴别培养，观察纯化后的菌落形态，并挑取单个菌落进行革兰氏染色，显微镜观察菌体染色特性及形态。

1.4 细菌生化试验挑取分离菌纯培养物无菌接种于葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇、过氧化氢酶、磷酸酶、氧化酶、靛基质、尿素等20种微量生化鉴定管[4]，37 ℃恒温培养24～48 h，观察并参照《伯杰细菌鉴定手册》判定反应结果。

1.5 细菌16S rRNA基因鉴定无菌挑取经纯化后的单个菌落于装有ddH2O 50 μL的无菌离心管中，参照煮沸法提取细菌总DNA[5]。参照文献方法合成细菌16S rRNA基因通用引物(27F：5’-AGAGT TTGATCATGGCTCAG-3’；1 492R：5’-TACGGTT ACCTTGTTACGACTT-3’。预期扩增产物长度约为1 400 bp)进行PCR扩增[6]。PCR反应体系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共33个循环；72 ℃终延伸8 min。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳并使用胶回收试剂盒回收目的片段，送至华大基因科技有限公司测序。测序结果经NCBI数据库进行BLAST同源性比对，选取部分参考菌株的16S rRNA基因序列，应用MegAlign软件进行核苷酸同源性比对及系统进化树分析。

1.6 细菌药敏试验采用纸片扩散法(K-B法)对分离菌进行药物敏感试验，挑取单个纯培养菌落接种于含5%新生牛血清的TSB培养基，置于恒温振荡培养箱，37 ℃ 160 r/min培养16 h，然后吸取菌液100 μL均匀涂布于鲜血琼脂培养基表面，用无菌镊子夹取药敏纸片紧贴于鲜血琼脂培养基，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径，参考抗微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI)进行结果判定。

2 结果

2.1 菌落及菌体形态细菌分离培养结果显示，在鲜血琼脂培养基上生长出表面光滑、半透明、有光泽、灰白色、直径1～2 mm、呈β溶血的凸起小菌落(见图1)。麦康凯培养基无菌落生长。分离菌经革兰氏染色，显微镜观察菌体形态为两端钝圆、无芽孢、单个或成对排列的革兰氏阴性短小杆菌(见图2)。

2.2 细菌生化特性分离菌能发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇；过氧化氢酶、磷酸酶、氧化酶、靛基质试验呈阳性；能分解尿素，不具运动性(见表1)。该分离菌生化特性与鸭源鸡杆菌相符，命名为GZ-LPS2019。

表1 分离菌生化鉴定结果

2.3 细菌16S rRNA基因PCR扩增结果PCR扩增产物长度约为1 400 bp，经纯化后测序得到大小为1 383 bp片段，与预期结果基本相符(见图3)。

2.4 细菌16S rRNA基因同源性及系统进化树分析分离菌GZ-LPS2019与8株鸭源鸡杆菌参考菌株的16S rRNA基因同源性高达98.2%～99.6%；与同属于鸡杆菌属的4株输卵管炎鸡杆菌和4株虎皮鹦鹉鸡杆菌的16S rRNA基因同源性分别为87.3%～91.4%、87.4%～92.8%(见图4)。系统进化树分析发现，分离菌株GZ-LPS2019与8株鸭源鸡杆菌参考菌株聚为1支且与参考菌株GQ423347.1亲缘关系最近，与4株输卵管炎鸡杆菌和4株虎皮鹦鹉鸡杆菌参考菌株均处于不同的分支(见图5)。结合分离菌的形态特征、生化特性及16S rRNA基因序列分析，确定分离菌为鸭源鸡杆菌。

2.5 药敏试验结果由表2可见：分离菌对羧苄西林、氧氟沙星高度敏感；对环丙沙星、多粘菌素B中度敏感；对复方新诺明、苯唑西林、丁胺卡那、头孢拉定、四环素等11种药物呈现不同程度的耐药。

表2 分离菌药敏试验结果 mm

3 结论

本试验通过对检测病料进行细菌分离培养、生化试验、16S rRNA基因鉴定及序列分析，综合鉴定分离菌为鸭源鸡杆菌，确诊该蛋鸡场乌蒙凤鸡发病原因为鸭源鸡杆菌感染。

4 讨论

4.1鸭源鸡杆菌易引起120～140日龄开产蛋鸡的输卵管炎和腹膜炎，导致产蛋量和蛋品质下降。该蛋鸡场开产蛋鸡的临床病例特点与鸭源鸡杆菌感染基本相符。

4.2家禽在饲养过程中如广泛使用抗生素会导致产生多重耐药菌株，对公共卫生也构成威胁。本试验结果发现，分离菌GZ-LPS2019对苯唑西林、青霉素、卡那霉素、四环素、红霉素等11种抗菌药物具有耐药性，为多重耐药菌株。方翟等[7]对湖北新洲地区鸭源鸡杆菌分离株进行药敏试验，发现该菌株对红霉素、恩诺沙星、苯唑西林、卡那霉素、四环素等多种抗菌药物具有耐药性；Hess Claudia等[8]调查了213株鸭源鸡杆菌的耐药性，结果发现大多数分离株对四环素、泰乐菌素、恩诺沙星等抗菌药物具有耐药性，且来源于蛋鸡生殖道的分离菌株相比其他器官的分离株呈现出更明显的耐药性。这些研究结果均与本实验结果相符。建议该场选用高度敏感药物羧苄西林、氧氟沙星进行有效治疗；在养殖过程中应严格控制抗菌药物使用，根据药物的休药期合理安排用药，同时在后续养殖过程中严禁盲目用药、滥用抗生素。