贵州发酵酸汤中携带真菌病毒的酵母菌筛选

张婷婷， 龙 慧， 滕 丽,3， 蔡小姚， 刘红美*

(1.贵州医科大学 生物与医学工程重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025)

山西人酷爱陈醋的酸，江浙人善用红醋的酸，而贵州人青睐发酵后的植物酸[1]。这种植物酸是贵州独特的民间饮食酸汤。贵州酸汤文化形成与当地地形、气候和经济等不利因素的影响有关，人民的生活用品短缺尤其是食盐的匮乏，加上气候潮湿，流行腹泻、痢疾等疾病[2]，贵州人们以酸代盐的烹调方法，创造出了既适应当地的恶劣环境又清香适口有保健作用的多品种酸汤[3]。研究表明，酸汤中富含多种有机酸、矿物质和益生菌，有调节人体肠道微生态平衡、助消化、防止便秘、降低胆固醇以及调节人体生理机能等作用[4]。

酸汤中的益生菌主要菌群有乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等[5]。酵母菌是指主要以单细胞形式存在，以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖，有性生殖阶段不产生子实体的真菌。酵母菌是单细胞真核生物，形态特征通常有椭圆形、球形、卵圆形、柠檬形或藕节形等[6]。大部分酵母菌的菌落特征和细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，易挑起；质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色均一；多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。酵母菌能在pH为3.0～7.5环境内生长，最适pH为4.5～5.0，最适生长温度为20～30℃[7]。

酵母菌在大自然分布非常广泛，在农业、医药、工业生产和科学研究中有较高应用价值[8]；如专用酵母菌种在动物营养领域的应用广泛，如作为微生态制剂、着色剂、单细胞蛋白质、发酵饲料原料等[9]；另外，有些酵母菌可导致食物和饮料腐烂，还有些酵母菌是人体的条件致病菌，能感染皮肤和黏膜系统，并在人体免疫功能低下或免疫系统受损时，引起致命的扩散性深部感染，给人类健康带来严重威胁[10]。如属于念珠菌属的白色假丝酵母菌是人类最常见的致病菌，感染后可引起皮肤黏膜念珠菌病、内脏念珠菌病及念珠菌血症等[11]。

真菌病毒是一类可以浸染丝状真菌、酵母和卵菌，并能在其中复制的病毒。1962年，HOLLINGS等[12]在英国通过电子显微镜在蘑菇栽培中发现了3种与疾病相关的球形或短杆状病毒。1967年，ELLIS等[13]通过电子显微镜在匐枝青霉(P.stoloniferum)的培养液中也观察到了病毒粒子。LAMPSON等[14]也发现绳状青霉(Renicilliumfuniculosttm)中的 dsRNA病毒可诱导绳索青霉菌诱导干扰素。在已有的研究基础上，BANKS等[15]进一步研究发现，匐枝青霉病毒(PenicilliumstoloniferumVirus；PsV)和绳状青霉病毒(PenicilliumfuniculosumVirus；PfV)的基因组均为dsRNA。在已报道的真菌病毒中，大多数病毒为RNA病毒，只有少数是DNA病毒。RNA病毒根据其基因组类型分为双链RNA病毒(double-stranded RNA dsRNA)和单链RNA病毒(ssRNA)。其中，绝大多数真菌病毒为dsRNA病毒，只有少数为ssRNA病毒。目前，真菌病毒主要分为14个科。其中，7个科为dsRNA病毒，5个科为ssRNA病毒，其余2个科为逆转录RNA病毒[16-19]。dsRNA病毒主要属于6个科，分别是呼肠孤病毒科(Reoviridae)、全病毒科(Totiviridae)、双分病毒科(Paritiviridae)、产黄青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分体病毒科(Quadriviridae)和巨型双节段病毒科(Megabirnaviridae)。全病毒科有5个属，分别是全病毒属(Totivirus)、维多利亚属(Victorivirus)、梨形鞭毛虫病毒属(Giardiavirus)、滴虫病毒属(Trichomonasvirus)和利什曼原虫病毒属(Leishmaniavirus)[20]。

酵母菌中携带有一类真菌病毒，属于全病毒科(Totiviridae)全病毒属(Totivirus)双链RNA病毒。此类病毒含2条基因组片段，按片段大小分别命名为L-A病毒片段(large-size)和M卫星杀手病毒片段(medium-size)。有研究表明，携带这类病毒的酵母菌株，通过分泌杀手毒素(Killer toxins；KTs)，也称为抗真菌蛋白(antifugal proteins)，消灭酵母菌株[21-22]。这类真菌病毒通过杀灭其他酵母菌株营造更多有利于自身的生存空间和资源，但同时也打破了原有的微生物动态平衡。因此，笔者通过筛选贵州发酵红、白酸汤中的酵母菌，检测其携带真菌病毒的携带率和多样性，为下一步研究携带真菌病毒的酵母菌如何调节贵州发酵红、白酸汤中微生物群落的动态平衡提供试验材料，为揭秘发酵酸汤独特口感提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 在贵州省都匀、仁怀、遵义和毕节地区用高压灭菌的2 mL离心管，收集酸汤样品，采集后保存于4℃冰箱，待分离。

1.1.2 试剂 YEPD固体培养基、头孢(100 mg/mL)、50×TAE、2×GPS、10% SDS、氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)、苯酚、无水乙醇、洗脱缓冲液、1×STE、3 mol/L醋酸钠(pH=5.2)、异丙醇、75%乙醇、DEPC-H2O、10×STE、1%(w/v)琼脂糖凝胶等。

1.1.3 仪器与设备 电子天平、pH调节计、电热鼓风干燥箱、立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台、移液器、电磁炉、微波炉、冰箱、立式超低温保存箱、琼脂糖凝胶电泳仪电源、4℃离心机、反渗透超纯水机、振荡器等。

1.2 分离纯化酵母菌

用移液枪吸取1 mL酸汤样品、9 mL无菌水置于10 mL试管中，振荡混匀，标记为10-1稀释度，用1 mL移液枪吸取1 mL 10-1稀释度的培养液于9 mL无菌水试管中，标记为10-2稀释度，依次稀释，共7个梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，用移液枪吸取100 μL菌液于YEPD固体培养基(含100 mg/mL头孢)的平板上进行涂布，每个稀释梯度平行涂布3个平板，28℃恒温培养箱培养24 h。挑取YEPD固体培养基中不同形态、不同大小的菌落在YEPD固体培养基上进行划线，在28℃恒温培养箱中培养24 h，经多次划线纯化得到单一菌落。

1.3 PCR反应期电泳检测

利用1.2方法提取的酵母菌DNA样品2 μL为扩增模板，引物ITS12 μL，引物ITS42 μL，ddH2O 19 μL，混合物25 μL，总体积为50 μL；空白不加样品，ddH2O改为21 μL，其余相同。扩增使用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR扩增程序：94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环。然后将5 μL PCR产物点样至1%琼脂糖凝胶(已加入染色液)的点样孔中，电压110 V，电流90 mA，时间约30 min。用凝胶成像仪观察电泳结果，将合格的PCR反应产物送检。

1.4 DNA和dsRNA的提取及纯化

挑取培养的目标菌株，将菌丝体在液氮冷冻条件下用碾钵研磨成粉末状，装入无菌离心管中。每0.4 g样品中依次加入600 μL 2×GPS、600 μL苯酚(Tris-HCl饱和，pH 8.0)、600 μL氯仿-异戊醇(体积比24∶1)和138 μL 10% SDS，剧烈振荡，使之充分混匀，12 000 r/min、4℃离心10 min。然后取上清液约600 μL，加入0.04 g CF-11纤维素粉末和114 μL无水乙醇，混匀后4℃冰浴过夜。然后离心机12 000 r/min离心5 min后弃上清液，倒扣滤纸上吸干残液，移液器加入600 μL清洗缓冲液，混匀后静置1 min；重复洗脱3次后，加入640 μL 1×STE，混合摇匀，12 000 r/min离心8 min并吸取600 μL上清液至新的无菌离心管中，加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠，加入1倍体积的异丙醇，充分混匀后于-20℃冰箱中静置2 h，12 000 r/min、4℃离心30 min，去除上清液，加入500 μL 75%乙醇，振荡无菌离心管，将沉淀弹起，清洗沉淀，12 000 r/min、4℃离心5 min后弃去上清液，用移液枪吸去管底的多余液体，风干沉淀10 min，加入20 μL DEPC-H2O，沉淀溶解完全得到菌株中的真菌病毒。样品在1%琼脂糖凝胶中电泳，用0.1 μg/mL溴化乙锭染色，紫外下观察各菌株携带真菌病毒的条带特征。

1.5 菌种的保藏

挑取经过ITS鉴定的酵母菌菌株，放在YEPD液体培养基的试管中，28℃振荡培养24 h。取0.5 mL培养的酵母菌液与0.5 mL的50 %无菌甘油以1∶1比例混合，标记菌种名称和保存时间，放于-80℃低温冰箱保藏。

2 结果与分析

2.1 采集的酸汤样品

2.1.1 收集 试验共收集了51份发酵酸汤样品，其中都匀市(DY)采集7管，仁怀市(RH)采集7管，遵义市桐梓县(TZ)采集9管，毕节市纳雍县(NY)采集26管(图1)。由图1可见，不同的发酵酸汤样品颜色深浅不一。另外，不同发酵酸汤样品的浓稠度也不同，这可能与发酵酸汤样品的发酵时间以及含有微生物的多样性不同有关。

2.1.2 样品的pH 由表1可知，从毕节纳雍县(NY)采集的26管发酵酸汤pH平均值趋于5.5，从仁怀市(RH)、都匀市(DY)、遵义市桐梓县(TZ)3地采集的发酵酸汤pH平均值趋于3.87。基于酵母菌能在pH为3.0～7.5内生长，最适pH为4.5～5.0，表明贵州发酵酸汤的酸度适合酵母菌株的生长繁殖。不同地区发酵酸汤pH不同，表明样品中微生物的多样性可能存在一定的差异。

表1 酸汤样品pH

2.2 YEPD培养基上微生物菌落形态

如图2所示，不同发酵酸汤样品在YEPD培养基上生长出不同菌落形态的微生物，从菌落颜色看，主要为乳白色、奶白色、灰白色、粉红色等；从菌落形状看，主要为椭圆、圆形，部分为放射状，菌落边缘多整齐均一，菌落侧面多为凸起、隆起或扁平，其表面多是光滑湿润，少数是干燥粗糙；菌落质地多样(紧实、松软易挑起、粘稠)；打开培养皿常伴有淡淡的发酵酒香。另外，在一些培养皿中也有丝状真菌和疑似细菌的菌落出现。

2.3 PCR扩增结果

从YEPD培养基上挑取疑似酵母形态的菌落，使用ITS1和ITS4引物扩增PCR后连接载体测序，最后筛选出47株酵母菌株(图3)。其中，Sacchaomycescerevisiae有21株，Zygosaccharomycesbailii有9株，Pichiakudriavzevii有6株，Candidatropicalis有4株，Candidautilis有3株，Kazachstaniahumilis有2株，Galactomycessp和Candidaglabrata各1株。

2.4 DNA和dsRNA真菌病毒的检测

由图4可知，检测样品共47孔，粗提dsRNA携带病毒条带的有37孔，携带率约79%；试验菌株中，病毒RNA的携带率高，且条带较多样化，主要出现在1～5 kbp。

3 结论与讨论

贵州发酵酸汤清凉解渴且风味独特，其中的益生菌群及丰富的营养成分可调整人体肠道微生物生态平衡，增进人体健康及预防消化道疾病等，另外发酵酸汤也可作为地方特产进行产业化生产，促进贵州经济的发展。虽然酸汤产业取得了一定的成绩，但快速健康地发展仍面临很多问题。酸汤产品在储藏过程中，常容易发生腐败变质，取代酸汤的清香变为氨臭，严重影响产品的感官品质[23]。

酵母菌属于单细胞真菌，多存在于含糖量高、酸度大的水生环境中，如贵州发酵酸汤是其较好的生存环境之一。长久以来，酵母菌因为生长快、代谢旺盛、特殊代谢产物繁多等特点而在食品、酒精、医药、饮料等行业被广泛应用，对酵母菌的资源研究和使用大大改善和丰富了人类的生活。此外，真菌病毒广泛分布于各种真菌和卵菌类群中，其中对寄主菌具有弱毒能力的真菌病毒具有作为生防资源的利用价值；有一类真菌病毒可以通过分泌杀手毒素杀灭同种或不同种酵母菌株[24-26]。而贵州发酵酸汤中的酵母菌为研究真菌病毒提供了切实可行的研究对象。

值得注意的是，有的条件致病真菌在自然界或25℃培养时呈菌丝形态(即菌落呈毛样)，而在组织中或在37℃培养时则呈酵母形态，这种因环境温度不同菌落形态亦不同的真菌称为双相真菌[27-28]。因此，在试验初期筛选酵母菌时，也要尽可能将非显著酵母菌形态特征的菌株进行粗提dsRNA。虽增大了筛选工作量，但也增加了筛选到目标菌株的可能性。

试验从贵州发酵酸汤中分离和鉴定出携带真菌病毒的酵母菌株，对携带真菌病毒的酵母调节贵州酸汤的微生物生态平衡研究既提供了大量目的菌株，也对后续研究真菌病毒的基因组序列及鉴定其病毒分类学分类地位起到重要作用。