真核表达载体介导的ICOSIg基因在大鼠脂肪间充质干细胞中表达的实验研究

耿洁，刘涛，姜锦，李光，黄志伟，王玉亮

诱导机体对自身抗原及移植物的耐受仍是免疫学科中的一项重大挑战。近年研究显示，T 细胞的活化与效应反应在自身免疫性疾病和急慢性移植排斥反应中占据主要地位［1］。可诱导共刺激分子（inducible co-stimulator，ICOS）是机体T 细胞免疫应答过程中重要的共刺激分子，其表达于活化的T 细胞表面，对维持效应T细胞的活化、调节CD4+T细胞的功能及调控T 细胞依赖性B 细胞具有重要的作用［2］。将ICOS的胞外片段与人免疫球蛋白（Ig）G Fc段基因融合而构建的融合蛋白ICOSIg 可阻断ICOS共刺激信号，从而抑制自身免疫性疾病进展和慢性排斥反应，有助于免疫耐受的建立。间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）作为细胞和基因治疗的载体，因发挥免疫调节与损伤修复的双重功能成为诱导特异性免疫耐受的治疗工具。Takahashi等［3］研究显示，MSCs与共刺激阻滞相结合可获得较高的胰岛移植物存活率。本文拟构建ICOSIg 基因修饰的脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs），旨在为后期免疫耐受机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料 健康SPF级雄性Lewis大鼠购自解放军军事医学科学院实验动物中心。聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；DMEM/F12培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；胰蛋白酶，成骨、成脂及成胰岛样细胞诱导试剂（美国Sigma公司）；细胞标记抗体（美国BD 公司）；TRIzol RNA 提取试剂盒（美国Invitrogen 公司）；MiniBEST凝胶DNA回收试剂盒（日本TaKaRa公司）；质粒载体 pcDNA3.1(+)、琼脂糖（美国 Invitrogen 公司）；EcoR Ⅰ、BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶、T4 DNA 连接酶（美国Thermo公司）；氨苄青霉素（Amp，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；DH5α感受态大肠杆菌、LB培养基和LB琼脂培养基、放免分析（RIPA）裂解缓冲液、5%BSA封闭液（北京索莱宝科技有限公司）；AxyPrep质粒小量提取试剂盒（美国Corning公司）；Amaxa 转染试剂盒（德国Amaxa 公司）；GAPDH 抗体（美国Thermo Fisher 科技公司）；重组Anti-ICOS 抗体（美国Abcam 公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（美国Abbkine公司）。梯度聚合酶链式反应（PCR）热循环仪（德国Eppendorf 公司）；凝胶成像分析系统（美国Alpha Innotech公司）；核酸/蛋白电泳设备（北京六一仪器厂）；FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 大鼠ICOS 胞外区编码序列的获得及合成 取雄性Lewis 大鼠1 只，收集外周血置于洁净的离心管中，EDTA 抗凝。淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，以oligod（T）为引物逆转录为cDNA。PCR扩增大鼠ICOS胞外区。另取人ADSCs细胞总RNA逆转录生成的cDNA 文库，PCR 扩增人IgG Fc 段编码序列。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，分别切胶回收401 bp的ICOS胞外区片段和1 012 bp的人IgG Fc片段。ICOS片段用BamHⅠ-EcoRⅠ双酶切，IgG Fc 片段用EcoRⅠ-XhoⅠ双酶切，再次1%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。

1.3 IgG Fc 克隆插入 pcDNA3.1（+）质粒 pcDNA3.1（+）（EcoRⅠ-XhoⅠ双酶切）8 μL，EcoRⅠ-XhoⅠ双酶切后的IgG Fc 片段2 μL，10×buffer 1.2 μL，T4 DNA 连接酶0.8 μL，室温（约22 ℃）反应4 h。取连接反应产物6 μL，热休克法转化DH5α 感受态大肠杆菌，铺LB/Amp+LB 琼脂培养基，37 ℃培养过夜。无菌吸头挑取数个单克隆菌落，接种于2 mL LB/Amp+LB 培养基中，37 ℃、220 r/min 振荡培养过夜。碱裂解法小量提取质粒。质粒产物进行EcoRⅠ-XhoⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，若出现约1 000 bp的目的条带则初步鉴定为正确的重组质粒。质粒产物经测序鉴定其正确性，重组成功的质粒命名为pcDNA3.1（+）/IgG Fc。

1.4 pcDNA3.1（+）/ICOSIg 融合基因表达载体的构建 pcDNA3.1（+）/IgG Fc（BamHⅠ-EcoRⅠ双酶切）2 μL，大鼠ICOS 胞外区序列（BamHⅠ-EcoRⅠ）8 μL，10×buffer 1.2 μL，T4 DNA连接酶0.8 μL，室温反应4 h。取连接反应产物6 μL，热休克法转化DH5α 感受态大肠杆菌，铺LB/Amp+LB 琼脂培养基，37 ℃振荡培养过夜。无菌吸头挑取数个单克隆菌落，接种于2 mL LB/Amp+LB 培养基中，37 ℃、220 r/min 振荡培养过夜。碱裂解法小量提取质粒。质粒产物进行BamHⅠ-EcoRⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，若出现约400 bp 的目的条带，则初步鉴定为正确的重组质粒，命名为pcDNA3.1（+）/ICOSIg。重组质粒最终经过测序鉴定。

1.5 大鼠ADSCs 分离培养及鉴定 另取雄性Lewis 大鼠1只，无菌技术下取单侧腹股沟脂肪垫，剪成1 mm3左右的小块后用D-Hanks 液洗涤至清亮后，加入Ⅰ型胶原酶消化，在37 ℃空气摇床中保持100 次/min 的速度进行震荡消化为乳糜状，加入D-Hanks液后离心去除上层乳糜层。加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基重悬细胞。细胞悬液过100 目滤网。取融合达90%的第2代ADSCs，应用流式细胞仪对细胞表面标志物进行鉴定，应用特定的染色方法鉴定ADSCs体外诱导多向分化的潜能。

1.6 重组质粒转染ADSCs 细胞 ADSCs 消化成单细胞悬液，用Amaxa转染试剂盒重悬ADSCs，调整细胞密度为5×106/mL。取100 μL的电转液细胞悬液至1.5 mL Ep管中，加2 μg的pcDNA3.1（+）/ICOSIg 质粒混匀后，立即转至电转杯中，使用Amaxa高效电转仪通过预先设定的程序转染，程序结束后立即加入预温至37 ℃的完全培养液中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。

1.7 Western blot分析ADSCs中ICOSIg表达 重组质粒转染ADSCs后72 h，用RIPA裂解液裂解ADSCs细胞，提取细胞总蛋白。10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离的蛋白电泳转移到聚二氟乙烯（PVDF）膜上。把膜放置在5%BSA 封闭液中孵育1 h，室温下膜和重组Anti-ICOS 抗体4 ℃孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的二抗室温下和膜孵育1 h，洗涤3 次，用增强化学发光（ECL）反应显色阳性条带，以GAPDH为内参。

2 结果

2.1 重组质粒的酶切鉴定EcoRⅠ-XhoⅠ双酶切重组质粒pcDNA3.1（+）/ICOSIg，电泳结果显示目的基因条带对应1 000 bp，见图1。BamHⅠ-EcoRⅠ双酶切重组质粒pcDNA3.1（+）/ICOSIg，电泳结果显示目的基因条带对应400 bp，见图1。所有酶切鉴定结果与理论预期相符，提示插入基因正确。

2.2 重组质粒的测序鉴定 选择酶切鉴定正确的重组质粒，将其中的插入片段经测序鉴定，与GenBank上公布的目标序列完全一致，无插入、缺失和移码突变，表明质粒构建正确，见图2。

Fig.1 Validation of the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/ICOSIg图1 pcDNA3.1（+）/ICOSIg质粒的酶切鉴定

2.3 大鼠ADSCs 的体外培养和鉴定 ADSCs 传代后细胞形态均一，主要呈长梭形，并呈几何倍数稳定增长。流式细胞仪检测ADSCs 表面标志显示，CD90、CD105 和CD73 表达均＞95%，呈阳性；造血干细胞表面标志CD34、白细胞共同抗原CD45 表达均呈阴性。在成脂、成骨及成胰岛样细胞诱导液培育下，细胞能够诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和成胰岛样细胞，进一步证实培养细胞为具有多向分化潜能的干细胞。见图3。

2.4 目的蛋白在ADSCs 细胞中的表达 将重组质粒转染ADSCs 细胞后，Western blot 结果显示，ICOSIg在ADSCs中高表达，见图4。

3 讨论

Fig.2 DNA sequencing graph of pcDNA3.1(+)/ICOSIg图2 pcDNA3.1（+）/ICOSIg重组质粒基因测序图

Fig.3 ADSCs were induced to differentiate into adipocytes,osteoblasts and islet-like cells(×200)图3 ADSCs诱导分化为成脂细胞、成骨细胞及成胰岛样细胞（×200）

Fig.4 Expression of ICOSIg detected by Western blot assay图4 Western blot检测ICOSIg融合蛋白在ADSCs细胞中的表达

3.1 构建ICOSIg 融合基因真核表达载体的意义 随着人们对免疫系统机制研究的深入，共刺激分子融合蛋白在免疫性疾病治疗中的应用前景值得关注。改善共刺激阻断剂的体内分布、增强药物局部浓度并延长药物代谢时间具有重要的研究价值。Fc融合蛋白的使用增加了疏水蛋白的溶解性，并通过增大分子质量延长蛋白的半衰期，同时增加了多价配体结合的亲和力，从而更适于体内应用［4］。除此之外，Fc 段具有介导补体依赖的细胞毒作用，可以结合Fc 受体，并介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）效应。目前，国内少见ICOSIg 真核表达载体的构建及相关的应用研究。本实验所构建的pcDNA3.1（+）/ICOSIg 质粒DNA 序列测序鉴定结果表明与目标序列完全匹配，无插入、缺失和移码突变，成功构建了真核表达重组质粒。ICOS与可诱导共刺激分子配体（ICOSL）相互作用所提供的共刺激信号对触发T细胞的关键活动起着重要作用，包括产生细胞因子、在不同的疾病模型中调节不同的T辅助细胞亚群及分化为辅助性T（Th）17 细胞和T 滤泡辅助（Tfh）细胞［2］。ICOS-ICOSL 通路在 T 细胞活化和移植免疫过程中起关键作用，因此它可作为治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应的理想靶点。利用ICOSIg 阻断ICOS-ICOSL 通路已在动脉内皮细胞移植［5］、心脏移植［6］以及移植物抗宿主病（GVHD）［7］动物模型中观察到移植物存活率增加。也有研究报道了相反的结果，ICOSIg 输注不能延长非人灵长类动物模型中移植物的存活时间，原因可能有：（1）ICOSIg与抗原提呈细胞（APC）上配体的结合也阻断了ICOS 与ICOSL 的相互作用，可能直接影响表达 ICOS 的其他 T 细胞亚群［8］。（2）ICOSIg的使用剂量可能不足以与APC上ICOSL作用完全，这一解释也得到了剂量增加实验的支持［9］。故应用融合蛋白技术及基因转染的细胞治疗技术解决共刺激阻断剂的半衰期短和剂量问题在移植排斥和自身免疫性疾病领域具有实际的应用价值。

3.2 ADCS的应用优势 近年来，细胞疗法在实体器官移植中受到了广泛关注，其中以MSCs 疗法为主的治疗手段得到了大力发展。使用ADSCs 作为细胞载体具有一定的潜在的优越性，包括：（1）取材方便，创伤小，给患者带来的痛苦少，治疗材料来源充足。（2）能作为免疫治疗和基因治疗的载体。（3）能按标准方法大规模生产。（4）自体细胞移植不涉及伦理问题。因此ADSCs 是一种在细胞治疗和组织再生领域具有临床应用前景的种子细胞。

3.3 ICOSIg 基因修饰ADSCs 的表达及意义 研究显示，利用基因工程技术将共刺激分子融合蛋白基因转染至MSCs在诱导免疫耐受中具有协同作用［10］。即当MSCs 迁移到目标组织时，共刺激分子融合蛋白可以在局部持续释放，同时持续发挥MSCs的旁分泌效应，从调节免疫应答、修复受损组织等多个方面参与疾病的发生发展过程，并且不存在诸如常规免疫抑制剂带来的全身不良反应。近年来，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 融合蛋白（CTLA-4Ig）和OX40Ig 基因修饰的MSCs在多种自身免疫性疾病与移植模型的实验研究中有一定进展，并显示出协同效应［10-11］。本研究将pcDNA3.1（+）/ICOSIg 重组质粒核转染 ADSCs，发现ICOSIg在ADSCs细胞中的表达水平均明显升高，表明重组质粒能够成功介导融合蛋白在真核细胞中的表达，是否对免疫应答具有协同抑制效应还有待进一步的实验研究。