miR-181c通过影响线粒体自噬发生调控锯齿状腺瘤癌变

李 敏，张春梅，荣 耕，王明明

(重庆医科大学附属江津中心医院、重庆市江津区中心医院病理科，重庆 402260)

锯齿状腺瘤是导致结直肠癌发生的重要因素[1]，其癌变的具体机制尚不明确，对其机制的深入研究具有重要临床意义。microRNA是一种长约22～24个核苷酸组成的单链非编码RNA，具有多种生物学功能，其在肿瘤性疾病中的作用备受关注[2]，如miR-181c在前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤等多种肿瘤性疾病中表达异常[3-6]，对肿瘤发生发展过程具有重要意义；此外，miR-181c可通过调控线粒体相关基因mRNA影响线粒体功能而发挥作用[7]。线粒体自噬(mitophagy)是细胞清除损伤线粒体的一种途径，可导致细胞凋亡的发生[8]。与线粒体自噬相关的PINK1、Parkin、Nix和Bnip3等重要分子，均为抑癌基因，这提示线粒体自噬在肿瘤性疾病中发挥着重要作用[9-10]。但miR-181c及线粒体自噬是否在锯齿状腺瘤癌变过程中发挥作用目前尚未见相关报道。本研究通过比较正常结肠组织、锯齿状腺瘤组织及结直肠癌组织中miR-181c的表达变化情况及线粒体自噬的发生情况，明确miR-181c在锯齿状腺瘤癌变中的作用。

1 材料与方法

1.1 组织标本来源

收集2015—2018年重庆医科大学附属江津中心医院经病理证实为锯齿状腺癌的病变标本20例为实验组，同时收集经病理证实为锯齿状腺瘤的病变标本20例作为对照组，所有实验标本均经患者知情同意。

1.2 细胞来源

细胞株：人正常结直肠黏膜细胞FHC细胞、人克隆结肠腺癌细胞Caco-2细胞购买于上海细胞研究所。

1.3 主要试剂和仪器

miScript Plant PT Kit逆转录试剂盒(德国QIAGEN公司)，实时荧光定量PCR反应试剂盒(中国TIANGEN公司)，PINK1(美国abcam公司，1:500稀释)，TOM20(美国abcam公司，1:100稀释)，HSP60(美国abcam公司，1:500稀释)和GAPDH抗体(美国abcam公司，1:1000稀释)。胎牛血清(美国Gibco公司)，1640培养基(美国Gibco公司)，lip2000转染试剂(美国Invitrogen公司)。ABI PRISM 7500定量PCR扩增仪(美国PE公司)，奥德赛扫膜成像仪(美国Licor公司)。

1.4 Real-time PCR

CCL4法提取组织或细胞总RNA。应用miScript Plant PT Kit试剂盒进行逆转录、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)反应，2-△△Ct检测miRNA表达变化情况。

1.5 细胞转染

将对数生长期的Caco-2细胞接种到细胞培养板中，并将其分为2组：实验组(mimic-181c转染组)和对照组(mimic-NC转染组)。待细胞增长至70%后，向实验组中转染入mimic-181c，对照组中转染入mimic-NC。转染后培养4 h后更换新的培养液继续培养，培养24 h后收集各自细胞进行real-time PCR实验；培养48 h后收集各组细胞进行蛋白质免疫印记(Western Blot)实验。

1.6 Western Blot检测PINK1、TOM20和HSP60等蛋白表达水平

研磨组织并提取组织蛋白，对蛋白样品进行预处理，配制蛋白电泳凝胶，对蛋白进行电泳，转膜，PVDF膜在封闭液中封闭，加入一抗孵育，加入荧光二抗孵育，扫膜成像。利用Image-Pro Plus 6软件，对Western blot图像进行灰度测定，计算各条带与对应的GAPDH的灰度比。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 miR-181c在锯齿状腺癌组织中表达减少

应用Real-time PCR检测所收集的锯齿状腺癌及锯齿状腺瘤组织中miR-181c的表达情况，结果显示，miR-181c在锯齿状腺癌组织中表达水平明显低于锯齿状腺瘤组织(P<0.05)，见图1。

2.2 miR-181c在Caco-2细胞中表达减少

应用Real-time PCR检测体外培养的FHC细胞和Caco-2细胞中miR-181c的表达情况。结果显示，miR-181c在Caco-2细胞中表达水平较FHC细胞中明显降低(P<0.05)，见图2。

2.3 锯齿状腺癌组织中线粒体自噬较锯齿状腺瘤组织发生减少

应用Western Blot检测锯齿状腺癌组织和锯齿状腺瘤组织中PINK1、TOM20和HSP60等蛋白的表达情况，结果显示，与锯齿状腺瘤组织相比，锯齿状腺癌组织中TOM20、HSP60表达较高，但PINK1表达减少(P<0.05)，见图3。

2.4 Caco-2细胞线粒体自噬发生较FHC细胞减少

应用Western Blot检测体外培养的FHC细胞和Caco-2细胞中PINK1、TOM20和HSP60等蛋白的表达情况，结果显示，与FHC细胞相比，Caco-2细胞中TOM20、HSP60表达较高，但PINK1表达减少(P<0.05)，见图4。

2.5 成功上调Caco-2细胞中miR-181c的表达

体外培养Caco-2细胞，并将其分为mimic-181c转染组和mimic-NC转染组，然后应用Real-time PCR检测2组细胞中mimic-181c表达情况，结果显示，与mimic-NC转染组相比，mimic-181c转染组中mimic-181c表达显著升高(P<0.001)，见图5。

2.6 上调细胞中miR-181c表达后可促进线粒体自噬发生

体外培养Caco-2细胞，并将其分为mimic-181c转染组和mimic-NC转染组，然后应用Western Blot检测2组细胞中PINK1、TOM20和HSP60等蛋白的表达情况，结果显示：与mimic-NC转染组相比，mimic-181c转染组中TOM20、HSP60表达减少，但PINK1表达增高(P<0.05)，见图6。

3 讨论

本研究通过检测分型锯齿状腺瘤组织和锯齿状腺癌组织中miR-181c的表达差异及其线粒体自噬的发生情况，发现miR-181c可能通过影响线粒体自噬的发生来调控锯齿状腺瘤癌变，对临床上预防和治疗锯齿状腺瘤癌变具有重要意义。

锯齿状腺瘤癌变途径是结直肠癌发生的重要途径之一，近期研究表明，microRNA在结直肠癌发生过程中发挥着重要作用，如SCHMITZ等[11]检测miR-21在锯齿状腺瘤和增生性息肉中的表达差异，发现可恶变的锯齿状腺瘤中miR-21的表达水平较无恶变风险的增生性息肉组织明显升高；而AOKI等[12]研究发现，miR-31在锯齿状腺癌中表达较正常结直肠组织明显升高，提示其为锯齿状腺癌癌变的一个关键分子。由此可见，miRNA的表达差异在锯齿状腺瘤癌变途径中可能发挥重要作用。但目前其具体机制尚不清楚。有研究[7]发现，miR-181c可负调控色素C氧化酶亚单位MT-COX1，又可促进MT-COX2的表达水平，破坏正常线粒体功能。线粒体是关乎细胞生命活动极其重要的细胞器，其数量及质量控制对维持细胞稳态至关重要。而当线粒体受损时，线粒体内膜电位去极化，将PINK1激酶稳定在线粒体内膜上，进而募集并激活Parkin(一种E3-泛素连接酶)依赖性的线粒体自噬，促进细胞凋亡的发生[8]。

本研究收集了经病理证实的锯齿状腺癌20例为实验组，锯齿状腺瘤20例为对照组，应用real-time PCR技术检测2组组织中miR-181c的表达变化情况，发现锯齿状腺癌组织中miR-181c表达较锯齿状腺瘤组织明显减少，随后在结直肠正常细胞FHC细胞及癌细胞Caco-2细胞中进行验证，发现Caco-2细胞中miR-181c表达较FHC细胞降低，与组织结果一致，提示miR-181c减少可能与锯齿状腺瘤癌变的发生相关。那么其是否是通过减少线粒体自噬的发生来促进该癌变的发生？为此，本研究应用Western Blot技术检测了2组组织中TOM20、HSP60和PINK1蛋白的表达情况，发现在锯齿状腺癌组织内TOM20及HSP60蛋白表达增加，而PINK1蛋白表达减少。TOM20及HSP60蛋白是线粒体剩余量的标志，其表达升高提示线粒体自噬减少；PINK1蛋白是线粒体自噬相关蛋白，其表达降低提示线粒体自噬减少。同时在FHC细胞及Caco-2细胞中进行验证，发现结果与组织实验一致，提示癌变的组织或细胞中线粒体自噬减少。应用细胞转染技术上调Caco-2细胞中miR-181c的表达，发现可促进线粒体自噬发生，提示miR-181c通过影响线粒体自噬发生而促进癌变。

INDRIERI等[13]研究发现miR-181a/b表达下降可调节线粒体稳态，减少神经元细胞死亡，可作为治疗线粒体疾病相关神经元病变的基因靶点。这与本研究结果相对应，提示miR-181家族可调控线粒体自噬的发生而影响细胞凋亡。但本实验只进行了miR-181c和线粒体自噬发生相关性的研究，未进一步进行因果关系分析及具体调控机制的探讨，不能排除混杂因素的影响；随后将进一步通过细胞及动物实验对miR-181c表达变化和线粒体自噬发生变化进行因果关系研究，并寻找miR-181c调控线粒体自噬的具体分子机制。

综上，miR-181c可能通过调控线粒体自噬发生参与锯齿状腺瘤癌变的过程，其有望成为结直肠癌的治疗靶点之一，具有重要的临床意义。