甘草酸的增溶作用探究

薛禾菲 张琬靖 刘 沛 刘翠哲

承德医学院中药研究所，河北 承德 067000

药物的水溶性一直以来是药物制剂研发过程中重点关注的问题。药物在水中的溶解度过低，在体内的溶出速率慢，生物利用度低，不利于发挥治疗作用。因此选择适宜的方法来提高难溶性药物的溶解度就显得非常重要。文献报道[1]三萜皂苷类成分具有表面活性剂的性质，可起到増溶的作用。甘草酸是一种应用广泛的三萜皂苷类成分，具有保肝，抗炎，抗菌，抗病毒，调节免疫等药理活性[2-3]，是甘草的主要有效成分。有研究发现甘草酸具有增溶作用[4]。利用甘草酸的这一性质，使之与水溶性较差的药物配伍使用，可以使这些药物的溶解度增加，让药物的疗效得到更好的发挥。

本实验选择薯蓣皂苷元和齐墩果酸两种药物来探究甘草酸的增溶作用。薯蓣皂苷元，是一种天然的甾体皂苷。齐墩果酸，为五环三萜类化合物。两种成分均分布于自然界多种植物中，来源广泛，且均具有保肝，抗炎，抗菌，抗病毒，调节免疫等多种药理活性[5-6]。二者在水中的溶解度都很低，直接给药，生物利用度较差。目前尚未见利用甘草酸提高薯蓣皂苷元和齐墩果酸溶解度的报道。本实验考察不同浓度甘草酸对薯蓣皂苷元和齐墩果酸在水溶液中溶解度的影响，初步考察甘草酸的增溶作用。

1 仪器与试剂

1.1 试剂 甘草酸原料药(西安绿之茵生物科技有限公司,批号：20190325)，甘草酸标准品(成都普菲德生物技术有限公司,批号：19032704)，薯蓣皂苷元原料药(南京春秋生物工程有限公司,批号：20170113)，薯蓣皂苷元标准品(成都普菲德生物技术有限公司,批号：16112803)，齐墩果酸原料药(江西安邦药业有限公司,批号：20160901)，齐墩果酸标准品(中国食品药品检定研究院,批号：110709-201607)均为分析纯；甲醇(Fisher Technology Inc, USA)，乙腈(Fisher Technology Inc, USA)，甲酸(Fisher Technology Inc, USA)均为质谱级；实验用水为屈臣氏蒸馏水(屈臣氏股份有限公司)。

1.2 仪器 AB SCIEX QTRAP 5500 质谱仪(美国AB Sciex 公司)，Waters Acquity UPLC 液相色谱仪(美国Waters公司)，HZQ-C气浴恒温振荡器(金坛市天竟实验仪器厂)，AG-254电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

2 方法与结果

2.1 薯蓣皂苷元溶解度考察

2.1.1 标准溶液的制备 取薯蓣皂苷元标准品2.0 mg，精密称定，于100 mL量瓶中，加入乙腈溶液充分溶解，摇匀，置于4℃冰箱保存。

2.1.2 测定条件的选择 色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×50 mm)；流动相：乙腈(0.03%体积分数甲酸)：水(含0.03%体积分数甲酸)= 85∶15；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：1 μL；洗脱时间5 min。

质谱条件：采用ESI离子源，正离子多反应监测(MRM)模式；电压：5.5 KV；离子源温度500 ℃；气帘气：35 Psi；雾化气(GS1)：50 Psi，辅助气(GS2)：50Psi。离子对m/z 415.2→271.2；去簇电压71.96 eV，碰撞电压23.03 eV。

图1 薯蓣皂苷元空白(a)和薯蓣皂苷元对照品(b)色谱图

2.1.3 线性范围考察 取薯蓣皂苷元对照品储备液，用乙腈稀释制备系列标准溶液(5～500 ng/mL)，进样，测定峰面积。以薯蓣皂苷元对照品溶液的质量浓度(ng/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标作直线回归。回归方程为y=32559x+146875(R2= 0.9997)。

2.1.4 精密度考察 取薯蓣皂苷元对照品储备液，乙腈稀释制备20、200、400 ng/mL不同浓度供试品溶液，进样，计算精密度。RSD分别为0.75%，0.81%和0.69%(n=6)。结果表明该方法精密度良好。

2.1.5 回收率考察 在含有0.05 mmol/L的甘草酸溶液中，加入薯蓣皂苷元对照品溶液，配制成为质量浓度为50 ng/mL的溶液，过滤，进样，用外标法计算。所测薯蓣皂苷元回收率为101.8%，RSD=0.35%(n=6)，符合测定要求。

2.1.6 样品的制备与处理 取一定量甘草酸加入90℃蒸馏水配制为甘草酸水溶液，外标法确定甘草酸含量，制备得到1 mmol/L甘草酸溶液，依次稀释得到1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0 mmol/L浓度甘草酸水溶液各10 mL。每种溶液分三份，每份3 mL，分别加入过量的薯蓣皂苷元，于37 ℃恒温气浴振荡器中振荡48 h，使溶解达到平衡。取样，用0.2 μm微孔滤膜过滤，续滤液用乙腈稀释五倍。取1 mL进样测定。

2.1.7 甘草酸对薯蓣皂苷元增溶作用 甘草酸溶液浓度的变化对薯蓣皂苷元溶解度的影响如图2所示，在不加入甘草酸时，薯蓣皂苷元在水中的溶解度仅为6.15 ng/mL。在加入甘草酸后，薯蓣皂苷元的溶解度随甘草酸溶液浓度的升高而增加，当甘草酸溶液的浓度达到1 mmol/L时，薯蓣皂苷元的溶解度为360.59 ng/mL，比薯蓣皂苷元在水中的溶解度增加约60倍。

图2 不同浓度甘草酸溶液对薯蓣皂苷元溶解度的影响

2.2 齐墩果酸溶解度考察

2.2.1 标准溶液的制备 取齐墩果酸标准品2.0 mg，精密称定，置于100 mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，置于4℃冰箱保存。

2.2.2 测定条件的选择 色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×50 mm)；流动相：甲醇(含0.03%体积分数甲酸)：水(含0.03%体积分数甲酸)=85∶15；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：1 μL；洗脱时间5 min。

质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式检测，离子喷雾电压-4500 V；电压：5.5 KV；离子源温度500 ℃；气帘气：20 Psi；雾化气(GS1)：30 Psi；辅助气(GS2)：30 Psi。采用多反应检测(MRM)模式；离子对m/z 455.3→407.4；去簇电压-50 eV,碰撞电压-55 eV。

2.2.3 线性范围考察 取齐墩果酸对照品溶液，用甲醇稀释为系列标准溶液(4～2000 ng/mL)，进样，测定峰面积。以齐墩果酸对照品溶液的质量浓度(ng/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标作直线回归。回归方程为y=618.43x+14562(R2=0.9995)。

2.2.4 精密度考察 取齐墩果酸对照品储备液，甲醇稀释制备20，250，1500 ng/mL不同浓度供试品溶液，进样，计算精密度。RSD分别为1.2%，2.0%和1.7%(n=6)。结果表明该方法精密度良好。

2.2.5 回收率考察 在含有0.05 mmol/L的甘草酸溶液中，加入齐墩果酸对照品溶液，配制成为质量浓度为50 ng/mL的溶液，过滤，进样测定。测得齐墩果酸回收率为98.2%，RSD=0.35%(n=6)。符合测定要求。

2.2.6 样品的制备与处理 取一定量甘草酸加入90 ℃蒸馏水配制为甘草酸水溶液，外标法确定甘草酸含量，得到1 mmol/L甘草酸溶液，稀释得到1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0 mmol/L不同浓度甘草酸水溶液各10 mL。每种溶液分三份，每份3 mL，分别加入过量的齐墩果酸，于37 ℃恒温气浴振荡器中振荡48 h，使溶解达到平衡。取样，用0.2 μm微孔滤膜过滤，用甲醇稀释五倍，取1 mL进样，测定。

图3 齐墩果酸空白(a)和齐墩果酸对照(b)色谱图

2.2.7 甘草酸对齐墩果酸增溶作用 甘草酸溶液浓度的变化对齐墩果酸的溶解度的影响如图4所示，在不加入甘草酸时，齐墩果酸在水中的溶解度为20.09 ng/mL。在加入甘草酸后，齐墩果酸的溶解度随甘草酸溶液浓度的升高而增加，当甘草酸浓度达到1 mmol/L时，齐墩果酸溶解度达到1155.36 ng/mL，比齐墩果酸在水中的溶解度增加约60倍。

图4 不同浓度甘草酸溶液对齐墩果酸溶解度的影响

3 讨论

本实验研究了甘草酸对薯蓣皂苷元和齐墩果酸的增溶作用，结果显示甘草酸表现出了比较明显和稳定的增溶效果。

甘草酸的增溶作用主要由于其结构上，同时存在亲水(两个葡萄糖醛酸残基)和疏水(三萜配基)部分，有类似表面活性剂的结构特点，可以改善疏水药物的水溶性。由于其分子中带有的三个羧酸基团的电离作用，甘草酸可以形成凝胶状或胶束状的聚集体[4]。在本实验制备甘草酸水溶液的过程中，也观察到了甘草酸溶液在较低温度下放置时间稍长，会出现胶凝现象。有文献报道甘草酸对纳米粒子表现出抑制晶体生长的作用，可以用作疏水纳米药物的沉淀抑制剂[7-8]。

甘草酸的增溶效果还与被增溶药物本身的结构特点相关。图2和图4的增溶曲线存在一定差异，甘草酸对不同结构药物的增溶作用不同。整体来看，在甘草酸浓度0～1 mmol/L范围内，薯蓣皂苷元和齐墩果酸的溶解度均随甘草酸浓度的增加呈增长趋势。

甘草酸表现出了非常好的改善难溶性药物水溶性和稳定性的性质，并且甘草酸是一种天然成分，被证明安全，无毒性，可用作甜味剂。相比于合成的表面活性剂，在生物相容性方面有明显的优势。而且不能被忽视的是，甘草酸作为一种中药的有效成分，其本身具有一定的药理活性。对于药理活性与甘草酸有重合的难溶性药物，甘草酸在提高难溶性药物溶解度的同时，可能也会表现出一定的辅助药理作用，包括增加药效[9]，和减缓毒性[10]等。甘草酸对薯蓣皂苷元和齐墩果酸发挥药理作用所产生的影响，包括是否存在协同作用，以及其它的体内相互作用，仍需要进一步的动物实验进行探究。

综上，甘草酸具有明显的增溶作用，可用于增加薯蓣皂苷元和齐墩果酸在水溶液中的溶解度。