知母皂苷AIII促进曲美替尼对肺癌A549细胞抑制活性的研究

肖 毅 朱欣婷 徐 卫 刘 云 李三华*

1. 遵义医科大学医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099；2. 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治重点实验室，贵州 遵义 563099；3. 遵义医科大学基础医学院，贵州 遵义 563099；4. 遵义医科大学药学院，贵州 遵义 563099

由于环境污染、吸烟、肺部感染等诱发肺部肿瘤因素的增加，肺癌已成为全世界发病率和致死率均位居前列的恶性肿瘤[1]。目前，以药物为主的化疗仍然是肺癌治疗的重要手段，但使用单一化疗药物治疗恶性肿瘤具有较多局限性，比如药物使用剂量大而导致毒副作用大，治疗过程种产生耐药而降低治疗效果等。药物联用具有能够实现药物间的协同效用提高治疗效果和降低药物使用剂量降低毒副作用等优点，药物联用治疗肿瘤已逐渐成为研究者和临床医生的关注重点之一。

来自于动物、植物和微生物的天然产物具有资源丰富、结构多样和作用靶点多等优点，是抗肿瘤药物的主要来源。皂苷是一类主要来源于植物的天然产物，是苷元为三萜或甾烷类化合物的一类糖苷物质。许多中药如知母、柴胡、人参等中均含有皂苷类物质，具有抗肿瘤、抗菌、调节免疫、心血管保护和降血糖等多种药理作用[2-4]。以皂苷类化合物为底物，通过生物转化还可获得结构新颖、活性优良、毒副作用小的皂苷转化物，皂苷类化合物是先导化合物和新药发现的重要来源[5]。知母是我国的传统中药，含有丰富的皂苷类活性物质；知母皂苷AⅢ(Timosaponin AⅢ)是知母中一种含量较为丰富的皂苷物质，是以菝葜皂苷元为母核，由菝葜皂苷元C-22 位的羟基脱氢后与两个果糖和一个葡萄糖缩合而成的多糖苷，有抗肿瘤、抗抑郁、改善记忆与降血压等多种药理作用[2]，具有开发为临床药物的前景。本研究发现知母皂苷AⅢ低使用剂量对肺癌A549细胞的抑制作用较微弱时却可以提高肿瘤靶向治疗药物曲美替尼(Trametinib)对细胞的抑制效应，研究结果对挖掘中药知母及其活性物质在肿瘤临床治疗中的应用具有参考意义。

图1 知母皂苷AⅢ的化学结构式

1 材料与方法

1.1 材料 知母皂苷AIII(Target Mol公司)，曲美替尼(百灵威科技有限公司)；A549细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)；RPMI1640培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；CCK8试剂盒与细胞周期检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)。

1.2 仪器 FC酶标仪(Thermo)；C6流式细胞仪(BD)；IX73显微镜(Olympus)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 A549细胞用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、链霉素100 IU/mL)于37 ℃、5%CO2和100%湿度环境中常规培养。

1.3.2 细胞生长检测 A549细胞以5×103个/孔的密度接种到96孔培养板中培养，细胞分为4组，每组6个重复孔；24 h后分别加入体积分数为2.5‰的DMSO(对照)、7.5 μM的知母皂苷AIII、5 μM的曲美替尼、7.5 μM的知母皂苷AIII+5 μM的曲美替尼；于加药后的24 h、48 h和72 h加入CCK8试剂，酶标仪测定520 nm光波吸光度值并计算细胞活率。细胞活率(%)=(OD对照组-OD药物组)/ OD对照组×100%。

1.3.3 集落形成检测 A549细胞以1×103个/孔的密度接种到6孔培养板中培养；24 h后细胞分为4组，分别加入体积分数为2.5‰的DMSO(对照)、7.5 μM的知母皂苷AIII、5 μM的曲美替尼、7.5 μM的知母皂苷AIII+5 μM的曲美替尼，加药24 h后更换新鲜培养基继续培养10 d，集落采用甲醇固定2 min后用吉木萨染料染色20 min，拍照观察。

1.3.4 细胞迁移检测 A549细胞以5×104个/孔的密度接种到24孔培养板中培养；24 h后细胞分为4组进行划痕实验，分别加入体积分数为2.5‰的DMSO(对照)、7.5 μM的知母皂苷AIII、5 μM的曲美替尼、7.5 μM的知母皂苷AIII+5 μM的曲美替尼；显微镜下拍照观察并测量细胞间划痕距离，即为0 h划痕距离；药物处理24 h后显微镜下拍照观察并测量细胞间划痕距离，即为24 h划痕距离。细胞相对迁移率(%)=(实验组0 h划痕距离-实验组24 h划痕距离)/(对照组0 h划痕距离-对照组24 h划痕距离)×100%。

1.3.5 细胞周期检测 A549细胞以每孔5×104万个/孔的密度接种到6孔培养板中；24 h后细胞分为4组，分别加入体积分数为2.5‰的DMSO(对照)、7.5 μM的知母皂苷AIII、5 μM的曲美替尼、7.5 μM的知母皂苷AIII+5 μM的曲美替尼；加药24 h后消化离心收集细胞，根据细胞周期检测试剂盒的操作流程操作并于细胞流式仪检测分析细胞周期。

1.2.6 数据统计分析 采用SPSS2.0软件对三次重复实验的数据进行方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长检测 由图2可知，当知母皂苷AIII单独使用时，对肺癌A549细胞的生长抑制效应较为微弱(约为20%)，随着作用时间的增加，抑制效果并未增强；但与曲美替尼联用时显著促进了曲美替尼对细胞的抑制效应，这种促进效应随着药物作用时间的增加而增加(P<0.05)，表明二者联用对A549细胞的生长具有协同抑制效应。

注：与CON组相比，*P<0.05；与Tim组相比，★P<0.05；与Tra组相比，#P<0.05。图2 A549细胞生长抑制效应

2.2 集落形成检测 由图3可知，知母皂苷AⅢ对A549细胞的集落形成无显著改变，曲美替尼对A549细胞的增殖能力有一定程度的抑制，使集落数量和集落大小均减少；当知母皂苷与AⅢ曲美替尼联合使用时，无集落形成，表明二者联用时对细胞的增殖能力有很强的抑制作用。

图3 集落形成

2.3 细胞迁移检测 由图4可知，与对照组相比，知母皂苷AⅢ对A549细胞迁移的抑制效应差异无统计学意义(P>0.05)，曲美替尼能显著抑制A549细胞迁移(P<0.05)；当曲美替尼与知母皂苷AⅢ联合使用时，抑制程度显著高于曲美替尼单独使用(P<0.05)，表明二者联用对A549细胞的迁移具有协同抑制效应。

图4 A549细胞迁移变化

2.4 细胞周期检测 由图5可知，知母皂苷AⅢ和曲美替尼单独使用时均使A549细胞的细胞周期进程阻滞于G0/G1，虽然知母皂苷AⅢ提高了曲美替尼的阻滞效果，但差异无统计学意义(P>0.05)，表明知母皂苷AⅢ不能显著提高曲美替尼对A549细胞的周期阻滞效果。

图5 A549细胞周期变化注：与CON组相比，*P<0.05；与Tim组相比，★P<0.05。

3 讨论

众所周知，肿瘤细胞中的多种信号通路常常是异常活化的，导致了细胞增殖失控和凋亡受阻等，与肿瘤的发生发展有密切关系。目前，以信号通路为靶点的靶向药物已普遍用于各种肿瘤的治疗，但针对单一通路或单一靶点的药物阻断某一信号通路以后可能会导致其他信号通路反馈性激活而使肿瘤细胞逃逸药物的作用，这是药物疗效逐渐下降的重要原因。联合用药同时作用于多个靶点，能产生更持久和有效的治疗效果，同时也可以降低用药量和减少毒副作用，已成为肿瘤治疗的研究热点。

曲美替尼(商品名：Mekinist)是RAS-RAF-MEK-ERK信号通路的抑制剂，于2013年被美国FDA批准用于治疗BRAF V600E或V600k基因突变的黑色素瘤。在临床二期试验中，对存在KRAS突变的IV期肺腺癌患者应用曲美替尼治疗，发现其治疗效果与多西他赛的治疗效果相近[6]。目前也有曲美替尼治疗肺癌的临床报道，患者的无进展生存时间达到6个月[7]，可见该药具有治疗肺癌的应用前景。有研究表明，曲美替尼作用于前列腺癌和结肠癌细胞后虽然抑制了ERK1/2的活性，却导致STAT3信号的异常激活[8]；曲美替尼作用于胃癌细胞后在降低了ERK活性的同时也使STAT3信号升高，而在隐丹参酮与曲美替尼共同作用下，胃癌细胞中的ERK和STAT3信号则同时被抑制[9]；当曲美替尼与西妥昔单抗联合用于结肠癌细胞时，可以有效抑制结肠癌细胞增殖并促进其凋亡，显著提高 KRAS与BRAF突变型结肠癌细胞对西妥昔单抗的药物敏感性，在体外实验中二者也具有协同效应[10]，以上研究结果提示曲美替尼与其他药物联合使用可能更有益于肿瘤的治疗。

知母为百合科植物知母的干燥根茎，是我国的传统中药，具有清热泻火、滋阴润燥等功效[11]。知母含有丰富的皂苷类物质，单体皂苷有40余种[12]。知母皂苷AⅢ是其中一种单体皂苷，具有多种药理作用，如抗肿瘤[13]、改善学习记忆功能[14]、抗凝血抗血栓[15]等。这些丰富的药理作用提示知母皂苷AⅢ有广阔的临床应用前景，但对于不同的疾病，知母皂苷AⅢ发挥功能的有效浓度和作用机制也可能存在较大差异。

本研究发现，当知母皂苷AⅢ在较小的作用浓度下对A549细胞无明显抑制效应时，却能提高曲美替尼对 A549细胞的生长、增殖和迁移的抑制，提示知母皂苷AⅢ和曲美替尼对肺癌细胞具有协同抑制的效应。但知母皂苷AⅢ是否通过抑制了曲美替尼反馈性激活的STAT3信号或其他信号来促进曲美替尼的作用有待于下一步的验证。此外，在动物水平是否存在该效应有待于建立动物的移植瘤模型和肿瘤转移模型来进行验证。由于中药知母中皂苷类物质较多，知母中的其他种类皂苷物质是否也有相似的作用效应也值得探讨。综上所述，研究突出了联合用药治疗肺癌的重要作用，提供了一种潜在的知母皂苷与曲美替尼联合用药治疗肺癌的方案。本研究只是初步探索知母皂苷联合曲美替尼对肺癌细胞A549的抑制活性，由本研究到临床试验还有很多问题需要解决，如知母皂苷联合曲美替尼抑制肺癌细胞A549活性潜在的分子机制、信号途径介导，以及动物水平是否有效等。