基于网络药理学和分子对接探讨血必净注射液治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的作用机制

郑 雅,刘志强,朱晓芹,王博龙*

(1.宜春学院化学与生物工程学院,江西 宜春 336000； 2.鹤壁职业技术学院,河南 鹤壁 458030)

自2019 年12 月以来,出现多起由于感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2)而引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病例[1-2]。 SARS-CoV-2 具有传播迅速、传染性强、各类人群普遍易感的特征。 截止2020 年6 月9 日13 时09 分,我国累计确诊患者84636 例,死亡病例4645 例；境外累计确诊患者7116552 例,死亡病例404157 例。 特别是近期美国、巴西、俄罗斯、西班牙、英国、意大利、法国等多个国家的激增态势,COVID-19 的防控现已成为全球挑战,寻找COVID-19 防治药物迫在眉睫。

由于SARS-CoV-2 是一种先前未在人类发现的β 属新型冠状病毒,目前没有特效治疗药物[3]。 我国专家及时分析评价前期治疗措施,不断更新COVID-19 的诊疗方案,为后续治疗提供指导。 《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》(试行第五版)于2020 年2 月4 日,由国家卫生健康委及中医药管理局发布,并首次增加了血必净注射液等解毒类中成药[4],这说明血必净注射液治疗COVID-19 确有疗效,但其治疗机理并不清楚。 本研究基于网络药理学方法,联合数挖掘、分子对接等技术手段解析血必净治疗COVID-19 的作用机制。

1 材料和方法

1.1 血必净主要成分及靶点筛选

本研究基于文献挖掘确定血必净注射液主要成分,借助TCMSP(http:/ /lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 数据库收集主要成分靶点, 利用ChemicaoBook 数据库(https:/ /www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx)查找主要成分分子结构式,保存 mol 格式文件后导入 Swiss Target Prediction(http:/ /www.swisstargetprediction.ch)数据库,利用相似性靶点搜寻方法查找靶点。 运用UniProt 数据库(http:/ /www.uniprot.org/)将靶点转换成为相应的基因名称,将检索出的基因合并后汇总,再运用Gephi 0.9.2 软件构建血必净成分-靶点网络。

1.2 血必净治疗COVID-19 靶点的确定

以“ Corona Virus Disease 2019 ”、 “ Novel coronavirus pneumonia” 为 关 键 词, 在 GeneCards(https:/ /www.genecards.org) 数据库中收集与COVID-19 相关的作用靶点合并后筛重,将血必净靶点与COVID-19 靶点相映射,得到血必净治疗COVID-19 的作用靶点,并绘制韦恩图。

1.3 血必净治疗COVID-19 靶点的器官定位

利用BioGPS((http:/ /biogps.org)对血必净治疗COVID-19 靶点进行器官组织定位分析,以高于平均水平确定该靶点所定位的器官或组织,并构建靶点-器官组织定位图。

1.4 关联网络构建与关键靶点筛选

在STRING 平台(https:/ /string-db.org/)导入血必净靶点并构建靶点群蛋白相互作用网络(proteinprotein interaction network,PPI network),物种设置为“Homo sapiens” (智 人), 结 果 保 存 后 导 入Cytoscape3.7.0 中分析并筛选关键靶点。

1.5 关键靶点基因本体GO 与KEGG 信号通路富集分析

分别运用 Omicshare 平台( http:/ /www.omicshare.com/tools/index.php/)和DAVID v 6.8 平台(https:/ /david.ncifcrf.gov)对血必净关键靶点进行GO 功能富集与KEGG 信号通路富集,并利用Omicshare 数据库进行富集点状图绘制。

1.6 成分-靶点分子对接

从TCMSP 网站搜索血必净主要成分结构式,从PDB 数据库(http:/ /www.rcsb.org/) 下载SARSCoV-2 病毒的3CL 水解酶及其人体受体血管紧张素转化酶II(ACE2)蛋白结构,运用Mgltools1.5.6 软件进行加氢、计算电荷等处理后,保存为pdbqt 文件。定义SARS-CoV-2 和ACE2 天然结合配体作为活性口袋,使用Autodock Vina 1.1.2 进行分子对接,取结合能最小的分子用Pymol 和Maestro 11.9 绘制分子对接图。

2 结果

2.1 血必净主要成分及主要成分-靶点网络构建

查阅文献[5-12]发现血必净主要成分有阿魏酸、苯甲酰芍药苷、丹参素、丹酚酸A、芍药苷、芍药内酯苷、洋川芎内酯I、原儿茶醛、原儿茶酸等22 种,详见表1。 在TCMSP 数据库和SwissTarget Prediction 服务器中获取22 种主要成分靶点数据,将数据合并、删重后得到血必净22 种主要成分作用于370 个靶点,见图1。

2.2 血必净治疗COVID-19 靶点的获取与收集

通过GeneCards 数据库获得与COVID-19 相关的靶点数目272 个,与血必净预测靶点相映射并绘制韦恩图,如图2 所示,相交集的54 个靶点即为血必净治疗COVID-19 的潜在靶点。

2.3 血必净治疗COVID-19 靶点的器官定位

为明确血必净作用的主要靶器官,将血必净治疗COVID-19 的54 个靶点导入BioGPS 数据库,以高于平均水平作为基因定位于某器官或组织的标准,由图3 可见,血必净54 个靶点中有47 个靶点位于肺,49 个靶点位于心脏,49 个靶点位于肝,47 个靶点位于全血,33 个靶点位于结肠,24 个靶点定位于小肠,12 个靶点位于气管,11 个靶点位于肾,8 个靶点位于胰腺。

2.4 血必净靶点关联网络构建及关键靶点筛选

将血必净54 个靶点输入STRING 数据库构建基因关联网络,如图4 所示,共有54 个节点、519 条相互作用连线构成关联网络。 图中节点的大小代表度值(Degree)大小,节点越大代表度值越大；节点边的粗细和颜色代表介数(Betweenness)大小,节点边越粗且颜色越深代表介数越大。 PPI 关联网络的平均度值为19.22,平均介数为1.28×10-2,平均最短距离(Closeness)为6.13×10-1,取均在平均值以上的14 个基因作为血必净治疗COVID-19 的关键靶点,详见表2。

表1 血必净主要成分基本信息Table 1 Basic information on the main components of Xuebijing

图1 血必净主要成分-靶点网络Figure 1 Xuebijing injection main ingredients - targets network

图2 血必净治疗COVID-19 的靶点维恩图Figure 2 Venn diagram of targets in the treatment of COVID-19 with xuebijing injection

2.5 血必净关键靶点GO 功能富集分析

利用OmicShare 云平台对14 个关键靶标进行GO 功能与富集分析,结果显示生物过程主要涉及生物过程调控、多细胞生物过程、免疫系统过程、细胞增殖、刺激反应、代谢过程、生物过程的调节、解毒等；分子功能及细胞组成主要涉及抗氧化活性、催化活性、细胞膜、细胞突触、细胞器等,详见图5。进一步富集发现血必净可能是通过参与细胞死亡的调节、脂多糖应答、蛋白质定位调节、细胞对有机物的反应、调节细胞蛋白质代谢过程、分子功能调节、细胞死亡等方面发挥作用,详见图6。

2.6 血必净关键靶点KEGG 信号通路分析

依据P＜0.05 筛选14 个关键靶点的KEGG 通路,共得到非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer)、甲型流感(Influenza A)、T 细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)、 肺 结 核(Tuberculosis)、单纯疱疹病毒感染(Herpes simplex infection)、朊病毒疾病(Prion diseases)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、HIF-1 信号通路(HIF-1 signaling pathway)、Toll 样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、PI3K-Akt 信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK 信号通路(MAPK signaling pathway)、FoxO 信号通路(FoxO signaling pathway)等信号通路。 图7 为上述20 条信号通路的高级气泡图,其中气泡颜色代表P 值的大小,RichFactor 代表富集的程度大小,气泡大小代表该通路中目标基因的多少。

2.7 血必净主要成分与SARS-CoV-2 3CL 水解酶及人体受体ACE2 的分子对接

将血必净22 个主要成分分别与SARS-CoV-2 3CL 水解酶(PDB ID:6LU7)和ACE2(PDB:1R4L)进行分子对接。 结果如表3 所示,血必净22 个主要成分与SARS-CoV-2 3CL 水解酶的结合能均小于-5.0 kJ/mol；与ACE2 的对接中,除羟基红花黄色素A 大于-5.0 kJ/mol 外,其余成分与ACE2 的结合能均小于-5.0 kJ/mol。 图8 为结合能最小分子的对接图,金丝桃苷与SARS-CoV-2 3CL 水解酶活性位点附近的LEU 141、GLU 166、ASP 187、THR 26 形成氢键,与HIS 41 形成Pi-cation 相互作用；木犀草苷与ACE2 活性位点附近的ALA 348 形成氢键、与HIS 345 形成Pi-Pi 相互作用、与HIS 505、ARG 273形成Pi-cation 相互作用。 这些氢键及相互作用促使小分子稳定结合到各自蛋白的活性位点上,进而抑制蛋白活性。

图3 靶点-器官组织定位图Figure 3 Targets-organ mapping

图4 血必净靶点关联网络Figure 4 The association network of Xuebijing injection genes

表2 关键靶标及其拓扑参数Table 2 The main targets and their topological parameters

图5 关键靶点的GO 功能分析Figure 5 GO function analysis of key target genes

图6 靶点的GO 富集分析Figure 6 GO enrichment analysis of target genes

3 讨论

COVID-19 患者大多表现为为发热、乏力和干咳等症状,预后良好。 但少数重型和危重型患者可快速进展为脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官衰竭等,往往预后不良[13]。 而研究发现SARS-CoV-2感染导致的免疫反应过激与炎症因子风暴是上述并发症产生,以及患者死亡的罪魁祸首[3]。 血必净注射液是我国被批准治疗脓毒症、全身炎症反应综合征及多器官衰竭的中成药,此药是根据我国著名中西医结合急救专家王今达教授提出的"四证四法"中医治则及"菌毒炎并治"理论,以血府逐瘀汤为基础,由红花、赤芍、川芎、丹参、当归5 味中药提取物精制而成,临床上在重症肺炎、烧伤脓毒症、慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫综合征等危重疾病患者治疗方案中广泛应用[14]。 专家组在总结COVID-19 前期治疗经验的基础上,于五版诊疗方案中首次推荐了血必净,而后六、七版诊疗方案[13-15]依旧推荐重型和危重型患者使用,再次肯定了血必净治疗COVID-19 的有效性。

为明确血必净治疗COVID-19 的确切机制,本研究挖掘血必净主要成分的作用靶点,并重点分析了关键靶点及其富集的生物过程、信号通路。 结果发现IL6、IL2、TNF、MAPK1、FGF2 等血必净关键靶点中多为免疫、炎症因子或相关受体,主要参与催化活性、抗氧化活性、细胞增殖等生物功能,以及脂多糖应答、刺激反应、代谢过程、免疫系统进程等生物过程。 关键靶点富集的通路主要有T 细胞受体、TNF、HIF-1、PI3K-Akt、MAPK、FoxO 等,其中调控免疫、炎症的通路为数最多,如调控免疫的T 细胞受体通路；调控炎症的TNF、MAPK、Toll 样受体等；而HIF-1 信号通路是众所周知的机体缺氧应激主要通路；甲型流感感染、单纯疱疹病毒感染、朊病毒疾病通路则涉及病毒感染的调控。 诸多实验研究证实血必净注射液主要通过抑制TNF-α、IL1、IL6、IL8、IL17 等促炎因子,抑制晚期炎症细胞因子高迁移率族蛋白B1 (HMGB1) 的表达,抑制Toll 样受体4(TLR4) /NF-κB 通路的激活发挥抗炎作用[16]。 许月球[17]的meta 分析显示血必净注射液能够改善脓毒症的免疫功能紊乱,这些都与我们的网络药理学研究结果保持了一致。 由此可见,缓和过激的免疫反应,抑制炎症因子风暴,进而减轻免疫、炎性损伤是血必净治疗COVID-19 的主要机制。

表3 血必净活性成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2 分子对接结果Table 3 Docking results of the active components of xubijing with SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2

图7 KEGG 通路富集Figure 7 KEGG pathway enrichment

图8 SARS-CoV-2 3CL 水解酶与金丝桃苷(1,2)和ACE2 与木樨草苷(3,4)的二维及三维分子对接模式Figure 8 2D and 3D Molecular docking diagram of SARS-CoV-2 3CL hydrolase(1,2)with hyperoside and ACE2 with cynaroside(3,4)

ACE2 是SARS-CoV-2 侵入人体的细胞受体,主要表达于呼吸系统上皮细胞,消化系统吸收性肠细胞、食管、回肠和结肠的上皮细胞中,表明消化系统和呼吸系统是SARS-CoV-2 入侵及损伤的首要器官[18],而临床上患者在发热、咳嗽的同时,往往伴有腹泻、恶心、厌食等消化道症状也说明了这一点。房晓伟[19]等分析了79 例COVID-19 患者的临床特征及实验室检查,发现SARS-CoV-2 感染还能造成患者(特别是重型和危重型)凝血系统、心脏、肝、肾等多个器官及系统的全面损伤,提示要积极防治多器官损伤,避免患者由普通型转化为重型和危重型。 本研究对血必净治疗COVID-19 的54 靶点进行器官定位,发现靶点主要富集在肺、心脏、肝、胰腺、气管、小肠、结肠、全血、肾等器官,与重型和危重型患者的多器官损伤情形完全吻合,说明血必净能够保护多个器官,产生协同治疗COVID-19 的作用,同时也再次印证了中医药物之间协同作用、整体论治的基本优势。

SARS-CoV-2 3CL 水解酶是病毒自身的一个关键蛋白,病毒需要利用它来复制RNA,被认为是抗SARS-CoV-2 病毒的有效靶点,饶子和/杨海涛课题组测定并提供了SARS-CoV-2 3CL 水解酶的高分辨晶体结构,为抗SARS-CoV-2 活性成分筛选奠定了基础[20]。 由于ACE2 在介导SARS-CoV-2 入侵细胞、促进病毒复制、加重急性肺损伤方面发挥重要作用,也是潜在的药物筛选靶点[21-23]。 在AutoDock软件中,一般以结合能小于-5.0 kJ/mol 为标准,来认定小分子化合物与靶蛋白之间具有较好的亲和力[24]。 本文分子对接显示血必净22 个主要成分中的绝大数与SARS-CoV-2 3CL 水解酶、ACE2 有较好的亲和力,其中与SARS-CoV-2 3CL 水解酶亲和力最大是金丝桃苷,与ACE2 亲和力最大的是木犀草苷、苯甲酰芍药苷。 因此,本研究推测血必净苷类成分可能具有一定的抗病毒潜力。

综上所述,血必净治疗COVID-19 的机理集中体现在两个方面,主要是通过调节人体免疫炎症反应来保护重要器官,其次还可能作用于病毒必需蛋白3CL 水解酶及其人体受体ACE2 而产生一定的抗病毒作用,具有多成分、多靶点、多通路、整体论治的协同优势。